菌種鑒定方法(菌種鑒定的方法)

1.菌種鑒定的方法

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內(nèi)容來自用戶：于秀蘭

菌種鑒定

篇一：菌種鑒定

中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心

CICC是我國唯一的國家級工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，有近三十年菌種分類鑒定的歷史，擁有先進的生物科學儀器和從事分類鑒定的專業(yè)化人員隊伍。CICC承擔全國工業(yè)微生物菌種的委托鑒定工作，所提供的菌種鑒定與評價技術(shù)服務獲得“國家工商總局（SCIC）經(jīng)營許可”，為國內(nèi)科研機構(gòu)、大專院校和生產(chǎn)企業(yè)等提供微生物菌種鑒定服務，涉及細菌、酵母、放線菌和絲狀真菌等多類微生物。菌種鑒定手段包括形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、BIOLOG碳源自動分析鑒定、分子生物學鑒定、API細菌數(shù)值鑒定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄層層析、全細胞脂肪酸分析鑒定、（G+C）mol%測定、DNA/DNA同源性測定等。

鑒定項目

序號服務項目菌種類別

1純菌種鑒定（包含形態(tài)、理化、分子）細菌、酵母、放線菌、絲狀真菌2功能基因鑒定（pheS、gryA、atpD等）乳桿菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌3產(chǎn)品微生物解析――

4產(chǎn)品污染菌種鑒定――

5菌群分析及純種分離――

6細胞壁化學組分分析（氨基酸）細菌、放線菌

7細胞壁化學組分分析（糖）細菌、放線菌

8 DNA(G+C)mol%含量細菌、放線菌

9 DNA/DNA雜交細菌、酵母、放線菌、絲狀真菌10脂肪酸分析細菌、放線菌CICCCICC

2.菌種鑒定常用的分離方法有哪些

菌種質(zhì)量檢測的目標包括菌絲形態(tài)、菌落特征以及子實體形態(tài)等方面。

質(zhì)量檢測常用方法如下： （1）建立標準的培養(yǎng)和觀察方法 對于一個栽培品種各菌種的質(zhì)量檢測，實際上是以該品種典型的生物學特性（包括形態(tài)特征、生理生態(tài)特性、栽培習性）為參照標準進行比較，以檢驗菌種是否存在品種退化、菌種老化、病菌侵染、雜菌污染和品種混雜等質(zhì)量問題。同時，菌種質(zhì)量檢測不僅要考慮從哪些方面來評價一個菌種的質(zhì)量優(yōu)劣，也要考慮用怎樣的標準方法對菌種質(zhì)量進行評價的問題。

因為一定的結(jié)果來源于一定的方法和一定的條件。方法和條件不同，結(jié)果就失去了可比性，也就無法鑒別，因此，需要建立標準。

這些標準包括：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（溫度、濕度、pH、光照等）、菌種的菌齡等。 （2）連續(xù)觀察 在菌種生長過程中，要連續(xù)觀察，一切不正常的現(xiàn)象只有在生長過程中才能表現(xiàn)出來。

而當菌種長滿培養(yǎng)基表面后，其不正?，F(xiàn)象往往會被菌種的過齡而掩蓋。 （3）宏觀檢查 對食用菌母種、原種及栽培種的宏觀檢查要根據(jù)其培養(yǎng)特征來進行（參見前述有關(guān)內(nèi)容），這是菌種生產(chǎn)者及使用者普遍使用的方法，簡單易行，但需要有多年的從業(yè)經(jīng)驗與技術(shù)沉淀。

如被檢菌種表現(xiàn)出菌落生長速度不一致、氣生菌絲變稀疏或出現(xiàn)扇變菌落、菌落上過早出現(xiàn)色素、或不同特征的菌落混雜共存、或菌落上出現(xiàn)黑褐色、青灰色、黃褐色或紅色的孢子堆，均可以確定該菌種存在質(zhì)量問題。優(yōu)質(zhì)菌種外觀菌絲潔白、密集粗壯，生長速度一致，齊發(fā)并進。

在生產(chǎn)實踐中，廣大菇農(nóng)和專業(yè)工作人員總結(jié)出“純、正、壯、潤、香”的質(zhì)量檢查方法。這種應用感官識別菌種優(yōu)劣，是經(jīng)驗的總結(jié)，能大致、快速地鑒定出菌種的優(yōu)劣。

具體方法是： “純”指菌種的純度高，無雜菌感染，無斑塊、無抑制線，無“退菌”、“斷菌”現(xiàn)象等。 “正”指菌絲無異常，具有親本正宗的特征，如菌絲純白、有光澤，生長整齊，連結(jié)成塊，具彈性等。

“壯”指菌絲發(fā)育粗壯，長勢旺盛，分枝多而密，在培養(yǎng)基上恢復、定植、蔓延速度快。 “潤”指菌種含水量適中，基質(zhì)濕潤，與瓶壁緊貼，瓶頸略有水珠，無干縮、松散現(xiàn)象。

“香”指具該品種特有的香味，無霉變、腥臭、酸敗氣味。 通過檢測各種食用菌菌絲生長的色澤、速度、均勻度等特征是否正常，來判斷菌種生長是否正常、是否可用，但辨別不了是否優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。

（4）顯微鏡檢查 對菌絲體進行顯微觀察，可以確定菌絲粗細、分枝、隔膜、鎖狀聯(lián)合等特性是否均一，是否與該栽培品種的典型特征一致（參見前述相關(guān)內(nèi)容）。具有不同形態(tài)特征的菌絲體存在于同一菌種體中，表明該菌種存在質(zhì)量問題；如果出現(xiàn)菌絲體重寄生現(xiàn)象，常表現(xiàn)出不同特征的菌絲體相互纏繞，或菌絲體中空變細，或在寄生點出現(xiàn)吸器等不正?，F(xiàn)象。

鏡檢的方法是：挑取少量菌絲，置載玻片中央的水滴上，用解剖針或接種針撥散，蓋上蓋玻片，也可加碘酒或美藍等染色后進行鏡檢。正常的菌絲一般透明、分枝狀，有橫隔和明顯的鎖狀聯(lián)合；異宗結(jié)合的食用菌，如僅有單核菌絲，不具結(jié)實性，不宜作菌種用；雙核菌絲中，鎖狀聯(lián)合多而密，則結(jié)菇力強，一般可認為是好菌種。

如： ①雙孢菇 觀察雙孢菇單孢子萌發(fā)后的菌絲生長形態(tài)。凡菌絲潔白、健壯，保存時間較長時菌絲顏色不變，較耐28℃以上氣溫，生長在基質(zhì)上平貼培養(yǎng)基表面，氣生菌絲不多的，為同化能力較強，產(chǎn)量較高的菌株。

相反，菌絲生長初期好，很快變黃變稀，如蜘蛛絲一樣，長出培養(yǎng)基表面菌絲較多的菌株產(chǎn)量較低。 ②香菇 觀察香菇的雙核菌絲，在斜面培養(yǎng)基上生長速度達到1.2厘米/天以上的，菌絲不十分粗壯和潔白，鎖狀連合頻繁，鎖狀連合在菌絲間相距較近，且在觀察面上分布均勻，一般均是高產(chǎn)和抗雜能力較強的菌株。

香菇出菇的密度與鎖狀連合有一定關(guān)系。 ③草菇 觀察草菇菌絲，發(fā)現(xiàn)菌絲分枝角度大的，出菇率高，產(chǎn)量高。

菌絲分枝角度小、平行排列的，產(chǎn)量低。 各種食用菌的菌絲生長是否正常、是否可用，一般都以色澤、速度、均勻度等特征加以檢測，但這并不能說明其是否優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。

（5）拮抗試驗 也稱對峙反應。同一種食用菌，經(jīng)分離或雜交，將選育出許多不同的菌株，這些菌株的菌絲在形態(tài)上很難區(qū)別。

如不同編號的香菇菌種，都是白色絨毛狀菌絲，鏡檢時均具有鎖狀聯(lián)合等。在當前菌種管理工作尚不十分健全的情況下，“同名異種”、“同種異名”的現(xiàn)象普遍發(fā)生，要識別異同，可采用“拮抗試驗”加以區(qū)別。

具體方法是： 用1支20毫米*200毫米的無底試管，中央部位裝入長 5~7厘米的木屑麩糠培養(yǎng)基，兩端壓平并蓋棉塞，滅菌后，兩端各接入兩株受檢的菌種 1小塊，25℃左右條件下培養(yǎng)，當兩端菌絲往中央生長并相互接觸后，把試管移至20℃、約300勒克斯的漫射光下繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌絲接觸區(qū)有無對峙反應。若無褐色的帶線出現(xiàn)，表示兩個受檢菌株的基因極相似或相同，是相同的菌株，僅編號不同，即同種異名。

如果受檢菌株間形成帶線，則表示是不同的菌株。 用平板進行拮抗試驗測試，方法是在無菌的PDA培養(yǎng)基平板上各接入2個或多個被檢菌株的菌種，在上述條件下培養(yǎng)，觀察菌。

3.請問一下菌種鑒定的方法和實驗步驟

實驗步驟：菌種鑒定工作是各類微生物學實驗室都經(jīng)常遇到的基礎(chǔ)性工作。

不論鑒定對象屬哪一類，其工作步驟都離不開以下三步：①獲得該微生物的純種培養(yǎng)物；②測定一系例必要的鑒定指標；③查找權(quán)威性的鑒定手冊。 一、經(jīng)典分類鑒定方法 群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等* 形態(tài) 個體：細胞形態(tài)，染色反應，各種特殊構(gòu)造等* 營養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長因子等* 生理、生化反應 酶；產(chǎn)酶種類和反應物性等* 代謝產(chǎn)物：種類，產(chǎn)量，顯色反應等* 經(jīng)典指標 生態(tài)特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等* 生活史特點* 血清學反應* 噬菌體的敏感性* 其它 經(jīng)典分類法 經(jīng)典分類法是一百多年來進行微生物分類的傳統(tǒng)方法。

其特點是人為地選擇幾種形態(tài)生理生化特征進行分類，并在分類中將表型特征分為主、次。一般在科以上分類單位以形態(tài)特征、科以下分類單位以形態(tài)結(jié)合生理生化特征加以區(qū)分。

* A. 能在 60 o C 以上生長 * B. 細胞大，寬度 1.3~1.8mm ………………… 1. 熱微菌屬 （ Thermomicrobium ） * B. 細胞小，寬度 0.4~0.8mm * C. 能以葡萄糖為碳源生長 * D. 能在 pH4.5 生長 …………………………… 2. 熱酸菌屬 （ Acidothermus ） * DD. 不能在 pH4.5 生長 …………………………………… 3. 棲熱菌屬 （ Thermus ） * CC. 不能以葡萄糖為唯一碳源 ……………… 4. 棲熱嗜油菌屬 （ 棲熱嗜獅菌屬 Thermoleophilum ） * AA. 不能在 60 o C 以上生長 二、現(xiàn)代分類鑒定方法 * 近年來，隨著分子生物學的發(fā)展和各項新技術(shù)的廣泛應用，促使微生物分類鑒定工作有了飛速發(fā)展。對微生物鑒定工作來說，已從經(jīng)典的表型特征的鑒定深入到現(xiàn)代的遺傳學特性的鑒定、細胞化學組分的精確分析以及利用電子計算機進行數(shù)值分類研究等新的層次上。

* （一）微生物遺傳型的鑒定* DNA是除少數(shù)RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。每一種微生物均有其自己特有的、穩(wěn)定的DNA成分和結(jié)構(gòu)，不同微生物間DNA成分和結(jié)構(gòu)的差異程度代表著它們間新緣關(guān)系的遠近。

因此，測定每種微生物DNA的若干重要數(shù)據(jù)，是微生物鑒定中極其重要的指標：1. DNA的堿基組成（G+Cmol%）* 每一個微生物種的 DNA 中 GC mol% 的數(shù)值是恒定的，不會隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個屬不同種之間， DNA 中 GCmol% 的數(shù)值不會差異太大，可以某個數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的 GC mol% 范圍。 DNA 中 GC mol% 分析主要用于區(qū)分細菌的屬和種，因為細菌 DNA 中 GC 含量的變化范圍一般在 25 %~ 75 %；而放線菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄 （37 %~ 51%） 。

一般認為任何兩種微生物在 GC 含量上的差別超過了 10 %，這兩種微生物就肯定不是同一個種。因此可利用 G+C mol %來鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠近程度。

值得注意的是，親緣關(guān)系相近的菌，其 G+C mol %含量相同或者近似，但 G+C mol %相同或近似的細菌，其親緣關(guān)系并不一定相似，這是因為這一數(shù)據(jù)還不能反映出堿基對的排列序列，而且如放線菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 ~ 51 之間，企圖在這么小的范圍內(nèi)區(qū)分放線菌的幾十個屬顯然是不現(xiàn)實的。要比較兩種細菌的 DNA 堿基對排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗。

1. DNA的堿基組成（G+Cmol%）* 1）每個生物種都有特定的GC%范圍，因此后者可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細菌的分類鑒定。

* 2)GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作出鑒定，并可檢驗表型特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。* 3）使用原則：* G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定每一種生物都有一定的堿基組成，親緣關(guān)系近的生物，它們應該具有相似的G+C含量，若不同生物之間G+C含量差別大表明它們關(guān)系遠。

但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。1. DNA的堿基組成（G+Cmol%）* 同一個種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應在4~5%以下；同屬不同種的差別應低于10~15%。

所以G+C含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項基本特征，它對于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。* 若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。

* 在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，G+C含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標。其分類學意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元。

2.核酸的堿基組成和分子雜交：* 與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對DNA的堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結(jié)果更加可信。DNA-DNA 雜交 * DNA 雜交法的基本原理是用 DNA 解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的 DNA 在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補的堿基重新配對結(jié)合成雙鏈 DNA ，然后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分數(shù)。

如果兩條單鏈 DNA 的堿基順序全部相。

4.食用菌菌種質(zhì)量鑒定的內(nèi)容和方法有哪些

1、外觀直接觀察鑒定

外觀菌種，菌絲濃白、粗壯、富有彈性，則生命力強；如果菌種菌絲萎縮，干燥無色澤，或菌絲體自溶產(chǎn)生了多量紅褐色液體，則生活力已變?nèi)?，不宜再用；木塊菌種如仍保持硬實，則屬于生活力強的菌種，如若木塊變得軟化松散，則已老化，不宜使用。

2、培養(yǎng)觀察鑒定

對于分離、選育和引進的菌種，通過培養(yǎng)，觀察菌絲體對干、濕度和溫度等方面的適應特性。如將菌絲體置于偏干、偏濕和干濕相宜的條件下培養(yǎng)，若菌絲在前兩種條件下能良好生長，而在干濕相宜的條件下生長最佳，則說明是好菌種。

3、液體培養(yǎng)鑒定

配制2%糖水溶液，經(jīng)常規(guī)滅菌消毒，挑取黃豆（4165, 7.00, 0.17%）粒大的菌塊，放入100毫升上述溶液中，置于25——28℃溫度下培養(yǎng)3——7天后，若液面出現(xiàn)氣泡，產(chǎn)生“油皮”，發(fā)生渾濁現(xiàn)象，說明菌種本身有雜菌；如果苗塊下沉，或遲遲才長出很薄的菌絲層，則說明菌種生活力弱；如若液面四周的菌絲生長快，且濃白呈棉絮狀，則表明菌種生命力強。

4、鋸木屑瓶栽鑒定和周期產(chǎn)量鑒定

瓶栽鑒定的做法與培育栽培的方法相似，把鋸木屑培養(yǎng)料裝得松一些，適當加大濕度，把需要鑒定的菌種接種于培養(yǎng)基中，做好記錄，在26℃恒溫下培養(yǎng)15天。然后使溫度降至15——20℃，并給予較好的散射光條件，再培育半個月左右，在瓶壁和料面上就會出現(xiàn)子實體原基和少量子實體。若未發(fā)現(xiàn)雜菌和異常現(xiàn)象，再把菌種接在木段上，做周期產(chǎn)量鑒定。如果子實體生長旺盛，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，具備優(yōu)良品種特性，并且沒有雜菌混生，說明菌種可靠，可以保存并投入大面積生產(chǎn)。實踐證明，以上菌種質(zhì)量的鑒定方法是比較科學的，可以篩選出優(yōu)良菌種，為廣大用戶服務。

5.微生物上,鑒別細菌菌種的方法有

首先如果你的菌株是自然界中分離得到，就只能鑒定到種，不能鑒定到株，因為多多少少和其他株系的細菌有區(qū)別，即便你做了一些特征的鑒定，發(fā)現(xiàn)和某一株細菌一模一樣，你也沒有理由說你的細菌就是那一株細菌，因為你不可能把所有的特征都做完，株和株之間的關(guān)系就相當于不同的人之間的關(guān)系，世界上不可能有完全相同的兩個人。除非你知道你的細菌本來就是某一株細菌擴增出來的（而且要保證沒有變異，否則就是一個新株），可是這樣就沒必要鑒定了。

菌種鑒定一般就只要提取基因組DNA，然后PCR擴增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon對比即可。一般序列相似度在97%以上就可以認為是同種細菌（當然也有例外，DNA序列僅僅是一個參考指標）。

6.如何鑒定菌種

在杏鮑菇、白靈菇生產(chǎn)中，只有具備優(yōu)良的菌種，通過科學的培育管理，才能實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效。因此菌種的優(yōu)劣是事關(guān)千家萬戶的切身利益和菌種生產(chǎn)廠家信譽的大事。在現(xiàn)實生產(chǎn)中，也常發(fā)現(xiàn)有的菌種廠以贏利為目的，粗制濫造。加之有些菇農(nóng)對菌種質(zhì)量缺乏識別能力，致使在生產(chǎn)中減產(chǎn)、絕收，造成巨大的經(jīng)濟損失。因此嚴格菌種質(zhì)量，加強對菌種的鑒定和識別是當前食用菌發(fā)展中的首要任務，也是最主要的技術(shù)環(huán)節(jié)和要求。

菌種質(zhì)量的鑒定，嚴格地講，應從形態(tài)、生理、栽培和經(jīng)濟效益等方面進行綜合檢測和評價。但要完成各種指標，除了需掌握一定的基礎(chǔ)知識和基本技術(shù)外，還需具備一定的儀器設(shè)備及人力物力和時間。因此，一般生產(chǎn)者是很難完成的。這里僅將幾種常用、簡便、易行的方法予以介紹，供生產(chǎn)者參考。

(1)直接觀察。

對引進的母種，首先要用肉眼觀察包裝是否符合要求，棉塞有無松動，試管有無破損，棉塞中有無雜菌和病蟲害侵染，菌絲色澤是否正常、有無老化等現(xiàn)象。購進或自制的原種，瓶內(nèi)菌絲應粗壯整齊、分枝濃密、色濃白呈絨毛狀，說明生長旺盛。如瓶底出現(xiàn)黃水、菌絲萎縮與瓶壁脫離，或出現(xiàn)原基扭結(jié)，說明菌種老化應淘汰。（2）菌種純度檢查。

杏鮑菇菌絲是純白色的，白靈菇菌絲較杏鮑菇菌絲稍淺些。如在菌種管或菌種瓶中出現(xiàn)其他顏色的菌絲或孢子（綠色、黃色、黑色等），則說明菌種不純，被雜菌污染不能使用。如果在接菌時發(fā)現(xiàn)菌種有異味也說明菌種被雜菌污染，不能使用。（3）吃料能力鑒定。

將母種接入最佳配方的原種培養(yǎng)基中，或?qū)⒃N接入栽培袋中觀察菌絲生長情況。經(jīng)1周的培養(yǎng)，如果菌種塊能很快萌發(fā)并迅速向四周的培養(yǎng)料中生長伸展，說明菌種的吃料能力強。反之，菌種塊萌發(fā)后生長緩慢，遲遲不向四周和料層深處伸展，則表明菌種對培養(yǎng)料的適應能力差。（4）觀察菌絲長勢。

可先將供測的菌種接入其適宜的試管培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，如果菌絲生長整齊濃密、健壯有力，則表明為優(yōu)良菌種。若菌絲生長緩慢或長速太快，稀疏無力，參差不齊，容易衰老，則表明菌種質(zhì)劣。（5）栽培試驗觀察。

這是菌種質(zhì)量鑒定最可靠的方法。通過一定的栽培試驗，凡具備優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗雜能力強和遺傳性穩(wěn)定的菌株，才是優(yōu)良和可推廣應用的品種。

7.細菌鑒定辦法有哪些,詳細些哦~~

一 淀粉水解試驗 （一）實驗原理 細菌對大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶將大分子物質(zhì)分解。

胞外酶能分泌擴散到細胞外，將物質(zhì)分解成小單位如糖、氨基酸、甘油與脂肪酸。這些小單位的物質(zhì)能被細菌吸收和利用。

水解過程可通過底物的變化來證明，如細菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測定不再產(chǎn)生藍色；水解明膠可觀察到明膠被液化；脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸改變培養(yǎng)基的pH，其中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色。（二）實驗方法 將淀粉培養(yǎng)基溶化后，冷至45℃左右，以無菌操作制成平板。

取18-24h的純培養(yǎng)物點于平板上，每皿可點種3-5個菌株，適溫培養(yǎng)2-4d，形成菌落后，在平板上滴加盧戈氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板成藍色。如果菌落周圍有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經(jīng)被水解，實驗為陽性，否則為陰性。

透明圈的大小一般說明水解淀粉的能力。（三）實驗試劑的配制 肉湯蛋白胨瓊脂成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL,pH7.2。

淀粉培養(yǎng)基制法：在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，校正pH值至7.6，分裝三角瓶，121℃ 20min滅菌備用。盧戈氏（Lugol）碘液：碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。

二 糖發(fā)酵試驗（一）實驗原理 單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度為0.75-1%。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種細菌經(jīng)37℃培養(yǎng)18-24小時，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有CO2和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。

（二）實驗材料 1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2.培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。

（三）實驗方法1.將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵管內(nèi)。 2.置37℃孵箱培養(yǎng)18-24小時。

3.觀察結(jié)果：由于一些細菌能分解某種糖類產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中pH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產(chǎn)酸者以“+”表示，如果同時產(chǎn)生氣體，則培養(yǎng)基中小倒管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，以“⊕”表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。

（四）實驗結(jié)果 傷寒桿菌 大腸桿菌 葡萄糖 + ⊕ 乳 糖 - ⊕ （五）實驗試劑的配制1.單糖發(fā)酵管的制備： 成分：蛋白胨水培養(yǎng)基 100ml ,0.2%酚紅 1ml ，所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g 制法： （1）將上述成分溶化，混勻分裝于內(nèi)含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約2ml，加塞。 （2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存?zhèn)溆谩?/p>

用途：供單糖發(fā)酵試驗用。 2.0.2%酚紅配制法 酚紅（phenol red）0.2g ,0.lmol/LNaOH 8ml ，蒸餾水 92ml 將酚紅入研缽徐徐加入0.lmol/LNaOH研磨，再補足蒸餾水即成。

若需長時間保存，可高壓滅菌后貯存?zhèn)溆谩?三 甲基紅（M.R）試驗（一）實驗原理 某些細菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基pH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應；若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為醇、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在pH 6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反應。

（二）實驗材料1. 菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18-24h瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2. 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。

3. 試劑：甲基紅試劑。 （三）實驗方法1. 分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。

2. 置37℃培養(yǎng)2-3天取出，分別滴加甲基紅試劑2-3滴，混勻，觀察結(jié)果。 （四）實驗結(jié)果 大腸桿菌：+，產(chǎn)氣桿菌：-。

（五）實驗試劑的配制1.甲基紅試劑的配制 甲基紅 0.04g, 95%酒精 60ml ， 蒸餾水 40ml 。先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸餾水，混合，搖勻即成。

2.葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物 成分：蛋白胨5g 葡萄糖5g 制法： （1）將上述成分溶解于蒸餾水中。 （2）調(diào)節(jié)pH至7.6，用濾紙過濾除渣。

（3）分裝中試管，每管約3-4ml，滅菌后備用。 用途：供甲基紅及V-P試驗用。

四 產(chǎn)吲哚（indole）試驗（一）實驗原理 某些細菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（無色吲哚），再與歐立希試劑（對二甲基氨基苯甲醛）反應，形成紅色化合物—玫瑰吲哚，即為陽性反應。 （二）實驗材料1. 菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2. 培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。 3. 試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對二甲基氨基苯甲醛） （三）實驗方法1. 分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養(yǎng)基中。

2. 置37℃培養(yǎng)2-3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑0.5-1ml于培養(yǎng)液面上，待1-2分鐘后觀察結(jié)果：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為吲哚試驗陽性，無紅色環(huán)即為陰性。 （四）實驗結(jié)果 大腸桿菌：+ ；傷寒桿菌：- 。

（五）實驗試劑的配制1.蛋白胨水培養(yǎng)基的制備 成分：蛋白胨10g 氯化鈉5g 蒸餾水1000ml 制法： （1）先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解，再加足蒸餾水量。 。