培養(yǎng)基的制備實(shí)驗(yàn)中用到的消毒方法?(培養(yǎng)基滅菌的方法)

1.培養(yǎng)基滅菌的方法有哪些

培養(yǎng)基的滅菌方法

1、高壓蒸汽滅菌：

高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養(yǎng)基在愛(ài)制備過(guò)程中混入各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)在24h內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時(shí)一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時(shí)，滅菌15~30min即可。消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，也不能超過(guò)規(guī)定的壓力范圍，否則有機(jī)物質(zhì)特別是維生素類(lèi)物質(zhì)就會(huì)在高溫下分解，失去營(yíng)養(yǎng)作用，也會(huì)使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來(lái)水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過(guò)瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無(wú)菌水。 滅菌后的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)3d，若無(wú)污染現(xiàn)象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時(shí)不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養(yǎng)基應(yīng)在1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不要超過(guò)1個(gè)月。

2、過(guò)濾滅菌：

一些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及有機(jī)物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細(xì)菌過(guò)濾器濾去其中的雜菌。細(xì)菌過(guò)濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進(jìn)行高壓滅菌。過(guò)濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。

2.培養(yǎng)基滅菌的方法有哪些

培養(yǎng)基的滅菌方法 1、高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。

培養(yǎng)基在愛(ài)制備過(guò)程中混入各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)在24h內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時(shí)一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時(shí)，滅菌15~30min即可。

消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，也不能超過(guò)規(guī)定的壓力范圍，否則有機(jī)物質(zhì)特別是維生素類(lèi)物質(zhì)就會(huì)在高溫下分解，失去營(yíng)養(yǎng)作用，也會(huì)使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來(lái)水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過(guò)瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無(wú)菌水。

滅菌后的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)3d，若無(wú)污染現(xiàn)象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時(shí)不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存。

含IAA或GA3的培養(yǎng)基應(yīng)在1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不要超過(guò)1個(gè)月。2、過(guò)濾滅菌：一些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及有機(jī)物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細(xì)菌過(guò)濾器濾去其中的雜菌。

細(xì)菌過(guò)濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進(jìn)行高壓滅菌。過(guò)濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。

3.培養(yǎng)基的制備與滅菌的實(shí)驗(yàn)中配制培養(yǎng)基時(shí)要注意哪些問(wèn)題

1、常用玻璃儀器的準(zhǔn)備 制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報(bào)紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理，也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養(yǎng)基的制備及儲(chǔ)存 （1）溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi).加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分.在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱(chēng)取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(zhǎng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞.（2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H.因此測(cè)定pH是培養(yǎng)基配制過(guò)程中的重要步驟之一，測(cè)定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2℃.調(diào)節(jié)pH可用無(wú)菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會(huì)比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會(huì)比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對(duì)培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測(cè)定，并記下每次pH的測(cè)定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對(duì)滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié).干燥培養(yǎng)基一般已校正過(guò)pH，用時(shí)也必須再驗(yàn)證.測(cè)定時(shí)，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計(jì)校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調(diào)整pH后要加熱過(guò)濾，使培養(yǎng)基澄清.（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準(zhǔn)和確認(rèn).每次使用前后，均要對(duì)分配器的管道系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，在分裝無(wú)菌培養(yǎng)基前，則要采用無(wú)菌硅膠管.固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應(yīng)在無(wú)菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用.分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)最佳）進(jìn)行滅菌處理.液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定.普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應(yīng)延長(zhǎng)至20min.含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細(xì)菌過(guò)濾器，過(guò)濾除菌.高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)到全部殺滅微生物.以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)，如不同類(lèi)型培養(yǎng)基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。

4.微生物中的培養(yǎng)基的配制與滅菌的具體操作是怎樣的

培養(yǎng)基的配制與滅菌 1目的1.1了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法1.2掌握各種實(shí)驗(yàn)室滅菌方法及技術(shù)。

2原理 培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素以及水分等。

另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。

加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98~100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。

任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。

3材料3.1器皿及材料 天平、稱(chēng)量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。3.2藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計(jì)、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

4流程 稱(chēng)藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過(guò)濾分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板。5步驟5.1培養(yǎng)基的制備5.1.1稱(chēng)量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱(chēng)取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。

蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。5.1.2溶解 用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。

待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。

5.1.3調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。

5.1.4溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分（水需預(yù)熱）。

注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。5.1.5過(guò)濾分裝 先將過(guò)濾裝置安裝好（圖3-1）。

如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾后立即進(jìn)行分裝。

分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。

固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。5.1.6包扎標(biāo)記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。

在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱(chēng)，制備組別和姓名、日期等。5.1.7滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。

普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面（圖3-2），斜面長(zhǎng)度一般以不超過(guò)試管長(zhǎng)度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

5.1.8倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45~50℃，立刻倒平板。5.2滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類(lèi)。

本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。

通過(guò)加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。

在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。5.2.1.高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法。

這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15~30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。

一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌（圖3-4）。5.2.1.1操作方法和注意事項(xiàng)如下 加水 打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。

立式消毒鍋?zhàn)詈糜靡阎箝_(kāi)過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。

裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。排氣 打開(kāi)排氣口（也叫放氣閥）。

用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。升壓、保壓和降壓 當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。

當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達(dá)。

5.實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有哪些

(1)加熱滅菌法 利用高溫來(lái)殺死微生物（超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度）的方法。

加熱滅菌的原理：當(dāng)高溫作用于微生物時(shí)，首先引起細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)速率加快，機(jī)體內(nèi)對(duì)溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體的變化、酶結(jié)構(gòu)的破壞，從而使細(xì)胞失去了生活機(jī)能上的協(xié)調(diào)，停止了生長(zhǎng)發(fā)育。隨著高溫的繼續(xù)作用，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結(jié)構(gòu)完全破壞，活動(dòng)消失，生化反應(yīng)停止，滲透交換等新陳代謝活動(dòng)消失，細(xì)胞死亡。

加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類(lèi)。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒(méi)有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱(chēng)為干熱滅菌法。

由于干熱滅菌使用方便，方法簡(jiǎn)單，故在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱(chēng)焚燒滅菌法。

采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來(lái)滅菌。

2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。

①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強(qiáng)的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時(shí)間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細(xì)菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時(shí)，可將壓力增加到0.152兆帕，延長(zhǎng)至1~2小時(shí)。

在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時(shí)，要完全排出鍋內(nèi)的空氣而以飽和蒸汽代之。

如果空氣不排除干凈，則鍋內(nèi)溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養(yǎng)基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。

所采用的蒸汽壓力與時(shí)間，應(yīng)根據(jù)待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類(lèi)型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。

它設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低，當(dāng)前使用最廣泛。只要砌一個(gè)爐灶，買(mǎi)1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過(guò)大，以裝800~1500瓶為好。

設(shè)計(jì)常壓灶時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來(lái)定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內(nèi)壁下流而不會(huì)打濕棉塞；灶倉(cāng)內(nèi)要有層架結(jié)構(gòu)，以便分層裝入滅菌物；灶上應(yīng)安裝溫度計(jì)，可隨時(shí)觀察灶內(nèi)溫度的變化；因滅菌時(shí)間長(zhǎng)，鍋內(nèi)水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉(cāng)的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節(jié)省燃料。菇農(nóng)在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。

這種方法不用建灶，簡(jiǎn)便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開(kāi)后保持8~10小時(shí)，悶一夜即可。

圖2-7 簡(jiǎn)易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復(fù)幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內(nèi)，100℃處理1小時(shí)左右，殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，讓其冷卻至30℃左右，此時(shí)芽胞會(huì)萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復(fù)3次，可達(dá)到滅菌目的。

該方法可用于不耐高溫的藥品、營(yíng)養(yǎng)物、特殊培養(yǎng)基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時(shí)間，殺死有害微生物的方法。

適應(yīng)于不耐高溫的物品消毒。有些培養(yǎng)基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營(yíng)養(yǎng)體，又能使培養(yǎng)基的成分不致受到嚴(yán)重破壞。

食用菌生產(chǎn)中培養(yǎng)料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個(gè)原理殺死其中的病蟲(chóng)、雜菌。 （2）過(guò)濾除菌法 又分液體過(guò)濾和空氣過(guò)濾兩種，就是采用機(jī)械的方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器，通過(guò)機(jī)械過(guò)濾，只讓液體培養(yǎng)基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達(dá)到除菌的目的。

這種方法適用于對(duì)熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基（如動(dòng)物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺(tái)的工作原理就是將帶菌空氣通過(guò)過(guò)濾滅菌形成無(wú)菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來(lái)造成工作臺(tái)范圍的無(wú)菌狀態(tài)。

過(guò)濾滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過(guò)濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。

（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱(chēng)輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線、β-射線、γ-射線、X-射線、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線、臭氧、日光為非電離輻射。

1）紫外線滅菌 紫外線殺菌的原理是利用紫外線的輻射作用。用燈管直接照射細(xì)菌使其發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，將細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復(fù)制而發(fā)生變性、致死。

另一方面，空氣在紫外線照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線的有效作用距離為1.2~2.0米。

紫外燈一般懸吊在接種室或培養(yǎng)室的上方，個(gè)數(shù)依房間大小而定，容1~2個(gè)人操作的接種室，安裝一個(gè)30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應(yīng)將所需的器具一起放入接種室（箱）內(nèi)，然后打開(kāi)紫外燈照射。

如果接種室體積較大，開(kāi)燈照射2小時(shí)。