QPCR的化學(xué)方法(qPCR實驗操作流程誰知道)
1.qPCR實驗操作流程誰知道
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Q-PCR實驗流程
一、①實驗前準(zhǔn)備，每天早上到實驗室后，先把超凈工作臺的紫外燈打開15-20分鐘。②超凈臺前做實驗，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。③取EP管/槍頭時需用鑷子，不可以用使用過的手套直接取用。取完EP管/槍頭后，袋子及時封好。④橡膠手套須放入超凈臺照射紫外，實驗操作過程中不得帶出超凈臺，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺面。⑤實驗進行的過程中或觀看實驗時，沒有帶口罩不要在超凈臺前講話。
二、總RNA抽提
1）細胞培養(yǎng)皿中細胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混勻，并吸至1.5ml RNase free EP管中使細胞充分裂解，室溫靜置5min;
組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱）
2）加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置3-5min；（離心時離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，與第一步的順序一致）
3) 4℃下，14,000g離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個新的RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上清，吸上清時，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）
4）沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min;
5)4℃下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀（如離心后仍不見EP管底部有沉淀，應(yīng)將EP管放置在-80度冰箱過夜，繼續(xù)在4℃下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀），去上清；
6）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺風(fēng)干；沉淀不能過干或過濕，過干則不易溶解，過濕則乙醇殘留。
7）視沉淀量加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。
可以去詳細了解 please click to connect
三、去基因組
使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下體系配置反應(yīng)液，37℃消化30min,65℃滅活10min。
2.幫忙解釋一下qPCR和FISH的原理
百度百科里有：
Realtime PCR（實時定量PCR）
定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。
實時熒光定量PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用：
1. DNA 或RNA 的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等
2. 基因表達差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ），特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證
3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等
Realtime PCR 常用的兩種方法分別為：Sybr green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）
SYBR green
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
此方法適用：
1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上
2、通用性好，不需要設(shè)計探針，方法簡便，省時，價格低廉。
3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。
4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測
5、專一性要求不高的定量PCR檢測。
Taqman Probe
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步
此方法適用：
1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。
2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。
3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。
4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。
5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。
6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量，在動物病原體基因的檢測，畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫，生物制品的鑒定。
（來源：GENELIFE Biotech 基萊生物）
3.請問什么叫QPCR
QPCR 問：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。
即實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)，簡稱QPCR。問：QPCR、DNA檢測、PCR之間的關(guān)系？答：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點榮獲93年諾貝爾化學(xué)獎。
因其在病原體檢測方面的獨特優(yōu)勢，因而發(fā)達國家在相關(guān)方法和儀器方面的研發(fā)非常快，成為分子生物學(xué)診斷的主流，至今仍處于學(xué)術(shù)和應(yīng)用前沿：第一代產(chǎn)品：基因擴增熱循環(huán)儀（DNA Thermal Cycler）+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑，構(gòu)成PCR定性檢測。第二代產(chǎn)品：基因擴增熱循環(huán)儀+熒光儀+終點定量試劑，構(gòu)成PCR-DNA終點法定量檢測（End-point quantitative PCR detection），又分為終點酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和終點熒光定量（End-point Fluor-PCR）兩種。
第三代產(chǎn)品：實時定量QPCR儀+實時熒光定量試劑，構(gòu)成QPCR-DAN/RNA實時熒光定量檢測。問：相比以前的方法，QPCR有哪些特點？答：QPCR至少有以下特點：所用儀器少，只用一臺儀器。
檢測時間短，只須45分鐘~1小時10分鐘（試劑各異），而定性PCR須3~4小時，酶免終點定量須6~8小時，熒光終點定量須2~3小時。操作極其簡單：前處理后，樣本插入儀器一小時后到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。
結(jié)果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點定量PCR由于只能在40個熱循環(huán)結(jié)束后檢測熒光，被測熒光達到飽和導(dǎo)致定量不夠精確，屬于半定量狀態(tài)。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續(xù)檢測各樣本的熒光值的變化，如圖一所示： 圖一 西安天隆TL988實際曲線1檢測動態(tài)范圍：10~10000000000 DNA copies/ml檢測精度：0.1RLU辨別率：5000和10,000個模板拷貝樣本的辨別率99.7%。
問：QPCR的技術(shù)先進性、價格及應(yīng)用現(xiàn)狀？答：實時熒光QPCR是當(dāng)今世界用于臨床的最先進核酸分子診斷技術(shù)，被美國FDA承認并推崇，被美國FDA批準(zhǔn)并取得臨床應(yīng)用執(zhí)照的QPCR試劑品種有：HBV乙肝病毒DNA,HCV丙肝病毒RNA,HIV艾滋病病毒RNA,Chlamydi trachomatis(CT)，性傳播疾病，沙眼衣原體，Neiserria gonorrhea(NG)，性傳播疾病，淋病雙球菌，Cytomegalovirus(CMV)，性傳播疾病，巨細胞病毒，Mybobacterium tuberculosis(Mtb)，呼吸道疾病，結(jié)核分支桿菌等。實時熒光PCR儀研發(fā)技術(shù)難度大，門檻高，發(fā)達國家也只有有限幾家知名公司生產(chǎn)，且售價昂貴：如美國ABI/7700-120萬元，美國ABI/5700-50萬元，瑞士Roche/Lightcycler-70萬元，美國Stratagene公司2005年新品MX3005P-80萬元 可見，在病人看來，哪家醫(yī)院應(yīng)用了QPCR技術(shù)便是先進診斷技術(shù)的象征，在發(fā)達國家也是如此。
國產(chǎn)儀器情況：國產(chǎn)儀器生產(chǎn)單位不超過五家，其中包括：日本獨資杭州博日實時熒光QPCR儀（33孔）西安天隆科技有限公司TL988實時熒光QPCR儀（48孔） 以上產(chǎn)品均取得國家SFDA認證，報價均在45萬以上。 國產(chǎn)試劑情況：多家公司生產(chǎn)實時熒光QPCR試劑盒，價格與終點法試劑相當(dāng)，且品種齊全，價格便宜，購買方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病雙球菌NG、沙眼衣原體CT、解脲支原體UU、皰疹病毒HSV、人體乳頭瘤HPV，優(yōu)生優(yōu)育系列：巨細胞病毒CMV、弓形蟲COX等。
編輯詞條 開放分類：病毒、DNA、PCR、分子生物、實時熒光定量PCR儀 參考資料： 1. /pcr%D2%C7 2. 貢獻者：zhang120jing、弦之月NONO。
4.定量分析方法有哪些
有五種，分別是：
1、比率分析法。根據(jù)不同數(shù)據(jù)做對比，得出比率。
2、趨勢分析法。根據(jù)一階段某一指標(biāo)的變動繪制趨勢分析圖。
3、結(jié)構(gòu)分析法。根據(jù)某一指標(biāo)占總體的百分比來觀察。
4、相互對比法。選取某兩個指標(biāo)作為一組進行對比。
5、數(shù)學(xué)模型法。建造適合某一指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型來觀察指標(biāo)的變化。
以上五種定量分析方法，比率分析法是基礎(chǔ)，趨勢分析、結(jié)構(gòu)分析和對比分析等方法是延伸，數(shù)學(xué)模型法代表了定量分析的發(fā)展方向。
拓展資料：
定量分析法（quantitative analysis method）是對社會現(xiàn)象的數(shù)量特征、數(shù)量關(guān)系與數(shù)量變化進行分析的方法。在企業(yè)管理上，定量分析法是以企業(yè)財務(wù)報表為主要數(shù)據(jù)來源，按照某種數(shù)理方式進行加工整理，得出企業(yè)信用結(jié)果。定量分析是投資分析師使用數(shù)學(xué)模塊對公司可量化數(shù)據(jù)進行的分析，通過分析對公司經(jīng)營給予評價并做出投資判斷。定量分析的對象主要為財務(wù)報表，如資金平衡表、損益表、留存收益表等。其功能在于揭示和描述社會現(xiàn)象的相互作用和發(fā)展趨勢。
百度百科-定量分析
5.化學(xué)檢測的方法有哪些
化學(xué)檢測的方法有哪些
一般分有機顏料，如酞青綠等；無機顏料如氧化鐵紅、鈦白；染料如還原桃紅、分散橙等.聚烯烴、PVC色母粒采用的是顏料，一般說染料不可用于聚烯烴著色，否則會引起嚴重遷移.
二、分散劑主要對顏料表面進行潤濕，有利于顏料進一步分散，并穩(wěn)定在樹脂中，同時必須與樹脂相容性好，不影響著色產(chǎn)品品質(zhì).聚烯烴色母粒分散劑一般采用低分子量聚乙烯蠟或硬酯酸鋅等.工程塑料色母粒分散劑一般采用有極性低分子量聚乙烯蠟、硬酯酸鎂、硬酯酸鈣等.三、載體樹脂
使顏料均勻分布并使色母粒呈顆粒狀.選擇載體需考慮與被著色樹脂的相容性，還要考慮母粒應(yīng)有良好分散性，因此載體的流動性應(yīng)大于被著色樹脂，同時被著色后不影響產(chǎn)品質(zhì)量.如選用熔體指數(shù)較大的同類高聚物，使母粒的熔體指數(shù)較高于被著高聚物，以保證最終制品的色澤一致.
6.分析化學(xué)實驗的分析方法有哪些
如果你指的是定量分析化學(xué)，分析方法有重量法和滴定法
重量法包括沉淀重量法、氣化法、電解法、萃取法等，重量分析方法適合于常量分析，相對誤差較小，但操作繁瑣，耗時較長。
滴定法包括酸堿滴定、配合滴定、氧化還原滴定、沉淀滴定四種方法。該方法簡便、快速、有足夠的準(zhǔn)確度，相對誤差較小，主要用于常量組分測定，但需要特定的指示劑。
有時候吸光光度法也被劃入化學(xué)分析的范疇，主要是因為吸光度測定前通常需要一個配合顯色的過程，這是一個化學(xué)過程。
