文庫構(gòu)建方法(cDNA文庫的構(gòu)建方法)
1.cDNA 文庫的構(gòu)建有哪些方法
cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定），要構(gòu)建一個高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細(xì)小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導(dǎo)下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進(jìn)行鑒定。
這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。
2.基因文庫構(gòu)建的過程、原理及方法
1 cDNA 文庫的構(gòu)建 1.1 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理與方法 cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構(gòu)建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提?。ɡ绠惲蚯杷犭曳?，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定），要構(gòu)建一個高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細(xì)小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo(dT) 引導(dǎo)下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復(fù)反應(yīng)），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進(jìn)行鑒定。
這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全長文庫 經(jīng)典 cDNA 文庫的構(gòu)建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 cDNA。
為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點所導(dǎo)致的局限性。
全長 cDNA 文庫，是指從生物體內(nèi)一套完整的 mRNA 分子經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測及進(jìn)行體外表達(dá)和通過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等。
目前所報道的對全長文庫的構(gòu)建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 （Invitrogen,USA） 使用說明進(jìn)行。判斷一個 cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。
1.2.1 直接從序列上評價 5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應(yīng)基因5'末端進(jìn)行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉(zhuǎn)錄起始點，一般加在5'帽結(jié)構(gòu)后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經(jīng)過酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。
3'端：同樣可以用其它生物已知的對應(yīng)基因3'末端進(jìn)行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。 1.2.2 用實驗方法證實 可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE,3'端 RACE，或者通過 Northern Blot 證實大小是否一致。
1.3 對 cDNA 文庫的分析 對 cDNA 文庫質(zhì)量的評價主要有兩個方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細(xì)胞中表達(dá)信息（即 mRNA 種類）的完整性，它是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標(biāo)。
文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構(gòu)建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數(shù)。庫容量取決于來源細(xì)胞中表達(dá)出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數(shù)，1個正常細(xì)胞含10000~30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細(xì)胞總計數(shù)群中所占比例少于0.5%時。
滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算（ P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設(shè)為99%;N 為文庫中以 P 概率出現(xiàn)細(xì)胞中任何一種 mRNA 序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù)；n 為細(xì)胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數(shù)；T 為細(xì)胞中表達(dá)出的所有 mRNA 的總拷貝數(shù)）。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。
在細(xì)胞中表達(dá)出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細(xì)胞中表達(dá)出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。
非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，編碼序列則是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應(yīng)出天然基因的結(jié)構(gòu)。
2 cDNA 文庫構(gòu)建的其它類型 2.1 均一化 cDNA 文庫 它是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達(dá)基因?qū)?yīng)的 cDNA 的拷貝數(shù)相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進(jìn)行。
3.如何建立自己的文庫
文庫不需要建立，你注冊了百度帳號，就有自己的文庫了。
登錄百度知道后，在頁面上方點“文庫”，再在右上角點“個人文庫”，然后點“我的貢獻(xiàn)”，就進(jìn)入你的文庫了。
在你的文庫里，可以看到你的文庫積分，以及你上傳或下載的文檔。
現(xiàn)在百度文檔可以復(fù)制，也可以免費收藏了。
復(fù)制方法：
打開百度文庫，用關(guān)鍵詞搜索你要的文檔。
找到文檔后，用鼠標(biāo)把文檔的文字拉變色，然后松開鼠標(biāo)，就能看到“復(fù)制”、“分享”，這兩個按扭了。
你點“復(fù)制”，就可以把文檔復(fù)制下來，粘貼到你的電腦里了。
收藏方法：
打開百度文庫，用關(guān)鍵詞搜索你要的文檔。
找到文檔后，打開文檔，在文檔的下面有“收藏此文檔”和“下載”兩個按扭
你點“收藏此文檔”，就可以把文檔收藏到你的文庫里了。
下載方法：
如果你文庫財富值足夠，去百度文庫搜索你想要的文檔直接下載就行了。
如果沒有文庫財富值，可以在知道里提問，求助其他網(wǎng)友幫你下載。
也可以先去賺文庫財富值，獲得文庫財富值方法：
1 上傳文檔
2 去評論別人的文檔（評論一次一分，每天最多加五分），和每天評論別人的文輯也可以（評論一次一分，每天最多加五分），一天共10分
3 注冊新的百度賬號，它會自動送你10分文庫財富
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5 給別人知道財富讓他幫你下載
6 做文庫任務(wù)，完成任務(wù)后會有財富值獎勵。
上傳文檔很難通過的，最好獲得文庫財富值的方法是第二種！
4.百度文庫如何建立
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百度文庫“文檔專輯”功能
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