浸漬法:浸漬法是將原料用適當(dāng)?shù)娜軇┰诔鼗驕責(zé)釛l件下浸泡出有效成分的一種方法。
具體做法是: 取適量粉碎后的原料,置于加蓋容器中,加入適量的溶劑并密蓋,間斷式攪拌或震搖,浸漬至規(guī)定時(shí)間使有效成分浸出。取上清夜,過(guò)濾,壓榨殘?jiān)喜V液和壓榨液, 過(guò)濾濃縮至適宜濃度, 可進(jìn)一步制備流浸膏, 浸膏,片劑,沖劑等。
按提取溫度和浸漬的次數(shù)可分為冷浸潰法,熱浸潰法,重浸潰法。 滲漉法:滲漉法是將原料粗粉濕潤(rùn)膨脹后裝入滲波器內(nèi),頂部用紗布覆蓋,壓緊,浸提溶劑連續(xù)地從滲漣器的上部加入, 溶劑滲過(guò)原料層往下流動(dòng)過(guò)程中將與有效成分浸出的一種辦法。
不斷加入新溶劑, 可以連續(xù)收集浸提液, 由于原料不斷與新溶劑或含有低濃度提取物的溶劑接觸, 始終保持一定的濃度差, 浸提效果要比浸潰法高,提取比較完全,但溶劑用量大。滲滾法可分為單滲漉法,重滲漉法,加壓滲漉法,逆滲漉法。
煎煮法:煎煮法是指用水作溶劑,將被提物加熱煮沸一定時(shí)間,以提取其所含成分的一種常用方法, 又稱(chēng)煮提法或煎浸法。 該法是將原料適當(dāng)?shù)那兴榛蚍鬯槌纱址鄯湃脒m當(dāng)容器中,加水浸過(guò)原料面,充分浸泡后,加熱煎煮2一3 次,每次l h左右。
直火加熱,要不斷攪拌以免焦糊。分離并收集各次煎出液,經(jīng)離心分離或沉濾過(guò)后,濃縮至所需濃度。
該法使用于有效成分能溶于水, 對(duì)濕,熱均穩(wěn)定且不易揮發(fā)的原料。 回流提取法: 回流提取法是用乙醇等易揮發(fā)的有機(jī)溶劑提取原料成分,將浸出液加熱蒸餾,其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷卻,重復(fù)流回浸出容器中浸提原料, 這樣周而復(fù)始,直至有效成分回流提取完全的方法。
回流法提取液在蒸發(fā)鍋中受熱時(shí)間較長(zhǎng),故不使用于受熱易破壞的原料成分的浸出。 連續(xù)提取法:為了彌補(bǔ)回流提取法中需要溶劑量大,操作較繁的不足,可采用連續(xù)提取法。
當(dāng)提取的有效成分在所選溶劑中不宜溶解時(shí), 若采用回流提取需提十幾次, 既費(fèi)時(shí)又過(guò)多耗費(fèi)溶劑,在此情況下,可用連續(xù)回流提取法,用較少的溶劑一次提取便可提取完全。
蛋白質(zhì)的分離純化方法:
一、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法
1、蛋白質(zhì)的鹽析法:中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱(chēng)鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽析。
2、等電點(diǎn)沉淀法:蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,但此法很少單獨(dú)使用,可與鹽析法結(jié)合用。
3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法:用與水可混溶的有機(jī)溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
二、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾:透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。超濾法是利用高壓力或離心力,強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。
2、凝膠過(guò)濾法: 也稱(chēng)分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。
三、根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離
1、電泳法:各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí),到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。
2、離子交換層析法:離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素),當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。
四、根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法
親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱(chēng)為配體(Ligand)的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在,每種類(lèi)型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學(xué)中的重要的一部分,至今還沒(méi)的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái),因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
(一)溶劑提取法: 1.溶劑提取法的原理:溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì),選用對(duì)活性成分溶解度大,對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑,而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來(lái)的方法。
當(dāng)溶劑加到中草藥原料(需適當(dāng)粉碎)中時(shí),溶劑由于擴(kuò)散、滲透作用逐漸通過(guò)細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi),溶解了可溶性物質(zhì),而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差,于是細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散,溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中,如此多次往返,直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí),將此飽和溶液濾出,繼續(xù)多次加入新溶劑,就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。 中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。
溶劑可分為水、親本性有機(jī)溶劑及親脂性有機(jī)溶劑,被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。 有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)多,其極性大而疏于油;有的親水性基團(tuán)少,其。
極性小而疏于水。這種親水性、親脂性及其程度的大小,是和化合物的分子結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。
一般來(lái)說(shuō),兩種基本母核相同的成分,其分子中功能基的極性越大,或極性功能基數(shù)量越多,則整個(gè)分子的極性大,親水性強(qiáng),而親脂性就越弱,其分子非極性部分越大,或碳鍵越長(zhǎng),則極性小,親脂性強(qiáng),而親水性就越弱。 各類(lèi)溶劑的性質(zhì),同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。
例如甲醇、乙醇是親水性比較強(qiáng)的溶劑,它們的分子比較小,有羥基存在,與水的結(jié)構(gòu)很近似,所以能夠和水任意混合。丁醇和戊醇分子中雖都有羥基,保持和水有相似處,但分子逐漸地加大,與水性質(zhì)也就逐漸疏遠(yuǎn)。
所以它們能彼此部分互溶,在它們互溶達(dá)到飽和狀態(tài)之后,丁醇或戊醇都能與水分層。氯仿、苯和石油醚是烴類(lèi)或氯烴衍生物,分子中沒(méi)有氧,屬于親脂性強(qiáng)的溶劑。
這樣,我們就可以通過(guò)時(shí)中草藥成分結(jié)構(gòu)分析,去估計(jì)它們的此類(lèi)性質(zhì)和選用的溶劑。例如葡萄糖、蔗糖等分子比較小的多羥基化合物,具有強(qiáng)親水性,極易溶于水,就是在親水性比較強(qiáng)的乙醇中也難于溶解。
淀粉雖然羥基數(shù)目多,但分子大大,所以難溶解于水。蛋白質(zhì)和氨基酸都是酸堿兩性化合物,有一定程度的極性,所以能溶于水,不溶于或難溶子有機(jī)溶劑。
甙類(lèi)都比其甙元的親水性強(qiáng),特別是皂甙由于它們的分子中往往結(jié)合有多數(shù)糖分子,羥基數(shù)目多,能表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性,而皂甙元?jiǎng)t屬于親脂性強(qiáng)的化合物。多數(shù)游離的生物堿是親脂性化合物,與酸結(jié)合成鹽后,能夠離子化,加強(qiáng)了極性,就變?yōu)橛H水的注質(zhì),這些生物堿可稱(chēng)為半極性化合物。
所以,生物堿的鹽類(lèi)易溶于水,不溶或難溶于有機(jī)溶劑;而多數(shù)游離的生物堿不溶或難溶于水,易溶于親脂性溶劑,一般以在氯仿中溶解度最大。鞣質(zhì)是多羥基的化臺(tái)物,為親水性的物質(zhì)。
油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強(qiáng)親脂性的成分。 總的說(shuō)來(lái),只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項(xiàng)性質(zhì)相當(dāng),就會(huì)在其中有較大的溶解度,即所謂“相似相溶”的規(guī)律。
這是選擇適當(dāng)溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。 2.溶劑的選擇:運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵,是選擇適當(dāng)?shù)娜軇?/p>
溶劑選擇適當(dāng),就可以比較順利地將需要的成分提取出來(lái)。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn):①溶劑對(duì)有效成分溶解度大,對(duì)雜質(zhì)溶解度?。虎谌軇┎荒芘c中藥的成分起化學(xué)變化;③溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。
3.提取方法:用溶劑提取中草藥成分,、常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時(shí),原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率,必須加以考慮。
1)浸漬法:浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝人適當(dāng)?shù)娜萜髦?,加入適宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水),浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡(jiǎn)單易行,但浸出率較差,且如用水為溶劑,其提取液易于發(fā)霉變質(zhì))須注意加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?/p>
2)滲漉法:滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中,不斷添加新溶劑,使其滲透過(guò)藥材,自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法小當(dāng)溶劑滲進(jìn)藥粉溶出成分比重加大而向下移動(dòng)時(shí),上層的溶液或稀浸液便置換其位置,造成良好的濃度差,使擴(kuò)散能較好地進(jìn)行,故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應(yīng)控制流速,在滲渡過(guò)程中隨時(shí)自藥面上補(bǔ)充新溶劑,使藥材中有效成分充分浸出為止。
或當(dāng)滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當(dāng)于:原藥材重的10倍時(shí),便可認(rèn)為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀滲淮液作為另一批新原料的溶劑之用。
3)煎煮法:煎煮法是我國(guó)最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿,不宜用鐵鍋,以免藥液變色。
直火加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌,以免局部藥材受熱太高,容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠,多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶,或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。
還可將數(shù)個(gè)煎煮器通過(guò)管道互相連接,進(jìn)行連續(xù)煎浸。 4)回流提取法:應(yīng)用有機(jī)溶劑加熱提取,需采用回流加熱裝置,以免溶劑揮發(fā)損失。
小量操作時(shí),可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶?jī)?nèi)裝藥材約為容量的%~%,溶劑浸過(guò)藥材表面約1~2cm。
在水浴中加熱回流,一般保持沸騰約:小時(shí)小放冷過(guò)濾,再在藥渣中加溶劑,作。
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