ip免疫共沉淀(請(qǐng)教做過免疫共沉淀的高手們談?wù)勗摲椒ê陀猛?

1.請(qǐng)教做過免疫共沉淀的高手們談?wù)勗摲椒ê陀猛?/h2>

飛秒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當(dāng)用預(yù)先固化在argarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的操作步驟比較多，同時(shí)由于在非變性條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以要得到一個(gè)完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不僅需要高質(zhì)量的抗體，同時(shí)對(duì)免疫沉淀體系也需要有嚴(yán)格的控制指標(biāo)。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)從：蛋白樣品處理；抗體-agarose beads孵育；抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌到最后的鑒定，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)關(guān)鍵步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。

2.什么是免疫共沉淀

免疫共沉淀基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，體外驗(yàn)證兩種分子之間是否存在相互作用的技術(shù)。它是免疫沉淀的延伸。基本原理是在含有已知抗原的細(xì)胞裂解液中，將已知抗原作為靶蛋白，檢測(cè)裂解液中可能存在與之有相互作用的蛋白。加入特定的抗體以及Protein A-Beads，會(huì)形成“抗原-抗體-Protein A-Beads”的復(fù)合物。在抗原抗體特異性結(jié)合沉淀靶蛋白的同時(shí)，存在相互作用的蛋白也能被沉淀下來，最終得到“蛋白-蛋白”的復(fù)合物。驗(yàn)證是否有相互作用蛋白的存在。

免疫沉淀與免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理及方法大致相似，所不同的是在免疫共沉淀中對(duì)靶蛋白的結(jié)合由另一個(gè)與之發(fā)生相互作用的蛋白所替代。因此實(shí)驗(yàn)屬于IP還是Co-IP取決于實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是目的抗原還是相互作用蛋白質(zhì)。