淀粉酶活性的測(cè)定(酶活力測(cè)定的注意事項(xiàng)有哪些)
1.酶活力測(cè)定的注意事項(xiàng)有哪些
1.底物濃度 除選擇適合的底物外，在實(shí)際應(yīng)用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應(yīng)速度V成雙曲線關(guān)系，在酶活性測(cè)定時(shí)，要求[S]達(dá)到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜，此時(shí)反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度，測(cè)定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應(yīng)條件一定時(shí)，酶濃度與反應(yīng)速度成正比。按照中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，只有[S]>>[E]時(shí)，酶才能被底物分子飽和，反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值。因此當(dāng)標(biāo)本酶活力過(guò)高時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后再加以測(cè)定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃，高于或低于最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測(cè)定溫度尚未統(tǒng)一，但常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多使用37℃。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響程度通常用溫度系數(shù)（Q10）表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃，化學(xué)反應(yīng)速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知，溫度的變化對(duì)酶活性有著重要影響，因此要求酶活性測(cè)定要在恒溫條件下進(jìn)行，溫度波動(dòng)要控制在±1℃。
4.離子強(qiáng)度和pH值 在最適pH時(shí)，酶的活性最強(qiáng)，高于或低于最適pH，酶的活性都降低，多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測(cè)定酶活性時(shí)，要求緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標(biāo)本含有多種緩沖溶質(zhì)，具有較強(qiáng)的緩沖能力。為了防止血漿或血清標(biāo)本緩沖溶質(zhì)對(duì)反應(yīng)液酸堿度的影響，使pH不致偏離設(shè)定值，標(biāo)本用量不宜過(guò)大，血漿或血清標(biāo)本體積/反應(yīng)液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類(lèi)輔酶是結(jié)合酶的輔助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的輔基，Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基，NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開(kāi)它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性，因此在酶活性測(cè)定時(shí)，就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時(shí)才有活性或活性較高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑，Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測(cè)定時(shí)，也要滿足酶對(duì)激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。重金屬離子和砷化物對(duì)巰基酶的抑制、有機(jī)磷對(duì)羥基酶的抑制屬于不可逆抑制；丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類(lèi)藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制；哇巴因?qū)a+,K+-ATP酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑使酶活性降低，在測(cè)定酶活性時(shí)，應(yīng)避免抑制劑的影響。
綜上所述，測(cè)定酶活性時(shí)，最適條件的選擇應(yīng)該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
2.酶活力測(cè)定的注意事項(xiàng)有哪些?
1.底物濃度 除選擇適合的底物外，在實(shí)際應(yīng)用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應(yīng)速度V成雙曲線關(guān)系，在酶活性測(cè)定時(shí)，要求[S]達(dá)到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜，此時(shí)反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度，測(cè)定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應(yīng)條件一定時(shí)，酶濃度與反應(yīng)速度成正比。按照中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，只有[S]>>[E]時(shí)，酶才能被底物分子飽和，反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值。因此當(dāng)標(biāo)本酶活力過(guò)高時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后再加以測(cè)定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃，高于或低于最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測(cè)定溫度尚未統(tǒng)一，但常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多使用37℃。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響程度通常用溫度系數(shù)（Q10）表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃，化學(xué)反應(yīng)速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知，溫度的變化對(duì)酶活性有著重要影響，因此要求酶活性測(cè)定要在恒溫條件下進(jìn)行，溫度波動(dòng)要控制在±1℃。
4.離子強(qiáng)度和pH值 在最適pH時(shí)，酶的活性最強(qiáng)，高于或低于最適pH，酶的活性都降低，多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測(cè)定酶活性時(shí)，要求緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標(biāo)本含有多種緩沖溶質(zhì)，具有較強(qiáng)的緩沖能力。為了防止血漿或血清標(biāo)本緩沖溶質(zhì)對(duì)反應(yīng)液酸堿度的影響，使pH不致偏離設(shè)定值，標(biāo)本用量不宜過(guò)大，血漿或血清標(biāo)本體積/反應(yīng)液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類(lèi)輔酶是結(jié)合酶的輔助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的輔基，Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基，NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開(kāi)它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性，因此在酶活性測(cè)定時(shí)，就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時(shí)才有活性或活性較高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑，Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測(cè)定時(shí)，也要滿足酶對(duì)激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。重金屬離子和砷化物對(duì)巰基酶的抑制、有機(jī)磷對(duì)羥基酶的抑制屬于不可逆抑制；丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類(lèi)藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制；哇巴因?qū)a+,K+-ATP酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑使酶活性降低，在測(cè)定酶活性時(shí)，應(yīng)避免抑制劑的影響。
綜上所述，測(cè)定酶活性時(shí)，最適條件的選擇應(yīng)該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
3.測(cè)定酶活性時(shí)應(yīng)注意些什么?
酶的活性測(cè)定要求有適宜的特定反應(yīng)條件，應(yīng)注意影響酶促反應(yīng)速度的各種因素應(yīng)該相對(duì)恒定。
1.酶的樣品應(yīng)做適當(dāng)?shù)奶幚怼?.反應(yīng)體系中，底物的量足夠使酶被底物飽和，以充分反映待測(cè)酶的活力。
但過(guò)高的底物濃度可能抑制酶的活性，一般底物濃度在10km以上。3.測(cè)定代謝物時(shí)應(yīng)保持酶的足夠濃度。
4.應(yīng)根據(jù)反應(yīng)時(shí)間選擇反應(yīng)的最適溫度。5.根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。
6.為獲取最高反應(yīng)速度，在反應(yīng)體系中應(yīng)含有適宜的輔助因子，激活劑等。7.測(cè)定酶活性時(shí)應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度。
4.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題,才能確保淀粉酶活性?
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類(lèi)總稱(chēng)，通常通過(guò)淀粉酶催化水解織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶的高效性及專(zhuān)一性，酶退漿的退漿率高，退漿快，污染少，產(chǎn)品比酸法、堿法更柔軟，且不損傷纖維。
淀粉酶的種類(lèi)很多，根據(jù)織物不同，設(shè)備組合不同，工藝流程也不同，目前所用的退漿方法有浸漬法、堆置法、卷染法、連續(xù)洗等，由于淀粉酶退漿機(jī)械作用小，水的用量少，可以在低溫條件下達(dá)到退漿效果，具有鮮明的環(huán)保特色。淀粉酶活性中度或輕度升高還可見(jiàn)于一些非胰腺疾病，如腮腺炎、急性腹部疾?。ㄏ詽兇┛?、上腹部手術(shù)后、機(jī)械性腸梗阻、腸系膜血管病變、膽道梗阻及急性膽囊炎等）、服用鎮(zhèn)痛劑、酒精中毒、腎功能不良及巨淀粉酶血癥等情況，應(yīng)加以注意。
5.淀粉酶活力的測(cè)定
谷物種子萌發(fā)時(shí)淀粉酶活力的測(cè)定 幾乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌發(fā)的禾谷類(lèi)種子，淀粉酶活性最強(qiáng)。
主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。種子萌發(fā)時(shí)，淀粉酶活性隨萌發(fā)時(shí)間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類(lèi)，供幼苗生長(zhǎng)。
α-淀粉酶隨機(jī)水解淀粉的α-1,4-糖苷鍵，作為淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解產(chǎn)物為麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原性糖；β-淀粉酶水解非還原端的第二個(gè)α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為麥芽糖，并能使一部分糊精糖化。本實(shí)驗(yàn)以萌發(fā)種子為材料，測(cè)定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差異。
【原理】 兩種淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在PH3?6以下迅速鈍化；β-淀粉酶不耐熱，在70℃下15Min則被鈍化。據(jù)此，在測(cè)定時(shí)鈍化其中之一，就可以測(cè)定出另一種酶的活力，本實(shí)驗(yàn)采用加熱鈍化β-淀粉酶測(cè)出α-淀粉酶活力，再與非鈍化條件下測(cè)得的總淀粉酶活力比較，求出β-淀粉酶活力。
淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糖及其他還原性糖能與3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原生成紅色3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測(cè)定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。
【儀器與用具】 分光光度計(jì)；離心機(jī)；恒溫水浴器；研缽；具塞刻度試管25Ml 13支，刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支。 【試劑】 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1Mg/Ml）：稱(chēng)取100Mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100Ml。
DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）：精確稱(chēng)取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20Ml 12Mol/L NAOH溶液中，加入50Ml蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100Ml。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。
若溶液混濁，可過(guò)濾后使用。 0?1Mol/L PH5?6的檸檬酸緩沖液：A液（0?1Mol/L檸檬酸）：稱(chēng)取分析純檸檬酸21?01g，用蒸餾水溶解并定容至1L;B液（0?1Mol/L檸檬酸鈉）：稱(chēng)取檸檬酸鈉29?41g用蒸餾水溶解并定容至1L；取A液55Ml與B液145Ml混勻，即為0?1Mol/L PH5?6的檸檬酸緩沖液。
1%淀粉溶液：稱(chēng)取1g淀粉溶于100Ml 0?1Mol/L PH5?6的檸檬酸緩沖液中。 【方法】 1.酶液提取稱(chēng)取25℃下萌發(fā)3~4天的小麥種子1?0g（芽長(zhǎng)1?0~1?5CM），置研缽中，加少量石英砂和2Ml蒸餾水，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，用7Ml蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管，提取液在室溫下放置提取15~20Min，每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)1次，使其充分提取。
然后在3000r/Min轉(zhuǎn)速下離心10Min，將上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為淀粉酶稀釋液。
2?麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表18-1加入試劑： 表18-1制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表 試劑管號(hào)1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.81.21.62.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.20.80.40麥芽糖含量（mg）00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水楊酸（ml）2222222搖勻，置沸水浴中煮沸5Min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20Ml。
以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nM波長(zhǎng)下比色測(cè)定。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3?酶活力的測(cè)定取6支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表18-2進(jìn)行操作。 表18-2酶活力的測(cè)定配方表 操作項(xiàng)目管號(hào)Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（ml）1.01.01.0000鈍化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min，取出后在流水中冷卻淀粉酶稀釋液（ml）000111DNS試劑（ml）2.0002.000預(yù)保溫40℃恒溫水浴中保溫10Min1%淀粉溶液（ml）(40℃)1.01.01.01.01.01.0保溫40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5MinDNS試劑（ml）02.02.002.02.0搖勻，置沸水浴中5Min，取出后冷卻，加蒸餾水至20Ml，搖勻，在540nM波長(zhǎng)下比色，記錄測(cè)定結(jié)果。
4?結(jié)果計(jì)算 用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值與Ⅰ-1吸光度值之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量（Mg），再按下式計(jì)算α-淀粉酶的活力（Aα），淀粉酶活性以每克鮮重所含麥芽糖毫克數(shù)（Mg/g·Min）表示： Aα=CαVTFW*t*V1(18-1) Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值與Ⅱ-1吸光度值之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量（Mg），按式18-1計(jì)算（α+β）-淀粉酶的活性AT AT=CT*VTFW*t*V1 式中A：淀粉酶活性，Aα為α-淀粉酶的活性，AT為淀粉酶總活性，主要是α、β-淀粉酶的活性； Cα：α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量（查標(biāo)準(zhǔn)曲線求值，以下同）； CT：（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量； V1：顯色所用酶液體積（Ml）; T：酶作用時(shí)間（Min）; VT：樣品稀釋液總體積（α-淀粉酶為50Ml，α+β淀粉酶為500Ml）; FW：樣品鮮重（g）。 【思考題】 1.萌發(fā)種子和干種子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差異這種變化有何生物學(xué)意義 2?實(shí)驗(yàn)中設(shè)置對(duì)照的意義何在 3?α-淀粉酶和β-淀粉酶性質(zhì)有何不同作用特點(diǎn)有何不同。
6.淀粉酶活力的測(cè)定
-淀粉酶活力測(cè)定 α-淀粉酶活力測(cè)定
Yoo改良法：兩份各5 ml 0.5%淀粉（用pH6.0 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制） 分別標(biāo)記為A、B，放入40℃恒溫水浴中保溫10分鐘，A中加0.5 ml酶液，B中加0.5 ml dH2O，反應(yīng)5 min后，各加5 ml 0.1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。分別從A、B取0.5 ml反應(yīng)液加入到于5ml 0. 4mmol/L I2-KI溶液顯色，620nm處測(cè)光密度OD?；盍挝欢x：5 min內(nèi)水解1mg淀粉的酶量。A(U/ ml) = ( R0-R)/ R0 *50*D
A：酶活； R0:B對(duì)應(yīng)的光吸收值；R:A對(duì)應(yīng)的光吸收值； D：酶的稀釋倍數(shù)
