真菌性污染的檢測(cè)方法(微生物室常用的病原真菌檢查方法)

1.微生物室常用的病原真菌檢查方法有哪些

您好！

1、真菌鏡檢

是最簡(jiǎn)單也是很有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便、快速，無(wú)菌部位的陽(yáng)性結(jié)果可直接確定真菌感染。但是由于陽(yáng)性率較低，陰性結(jié)果亦不能排除診斷。直 接鏡檢對(duì)于淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發(fā)或甲標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對(duì)相應(yīng)真菌病的可靠診斷。如在無(wú)菌體液的 直接鏡檢中發(fā)現(xiàn)真菌成分?？纱_立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測(cè)到帶莢膜的新生隱球菌酵母細(xì)胞，或外周血涂片中檢測(cè)到莢膜組織胞漿菌細(xì)胞。但一般在 有菌部位則只有發(fā)現(xiàn)大量真菌菌絲方才有意義，通過(guò)直接鏡檢一般可以區(qū)分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，進(jìn)一步明確鑒定菌種需要通過(guò) 培養(yǎng)鑒定來(lái)完成。

2、真菌培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室檢查中的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)出致病真菌是進(jìn)一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養(yǎng)第一步是從臨床標(biāo)本中培養(yǎng)真菌的初代培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后進(jìn)一步進(jìn)行 分離純化培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)。不同致病真菌每一步所采用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度存在一定的差異。常規(guī)的真菌培養(yǎng)需要在28-30°C溫度下培養(yǎng)3-4 周，一般初代培養(yǎng)選用沙氏培養(yǎng)基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），采用試管培養(yǎng)，一般同時(shí)培養(yǎng)兩管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或慶大霉素均 可）。在培養(yǎng)1周內(nèi)，應(yīng)該每天觀察有無(wú)真菌生長(zhǎng)。一般培養(yǎng)4周后，如果無(wú)真菌生長(zhǎng)可報(bào)陰性。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養(yǎng)后，用乳酸酚棉蘭 制成涂片顯微鏡下觀察，結(jié)合菌落大體形態(tài)，典型菌種可直接報(bào)告種屬。不典型菌種根據(jù)基本表現(xiàn)，采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，必要時(shí)要結(jié)合 生理學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

3、真菌鑒定

對(duì)常見(jiàn)致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區(qū)分酵母菌和霉菌。

如果初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)出酵母樣菌落，在鑒定前應(yīng)進(jìn)行分離純化。在去除細(xì)菌和其他真菌污染，區(qū)分混合感染后，對(duì)純菌落進(jìn)行鑒定。酵母菌鑒定主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特 征和生理生化特點(diǎn)，按照一定的流程進(jìn)行。首先根據(jù)菌落顏色進(jìn)行分類(lèi)。臨床最為常見(jiàn)的是白色或奶白色菌落，這類(lèi)菌進(jìn)一步做芽管試驗(yàn)，若芽管試驗(yàn)是陽(yáng)性則為白 念珠菌，若陰性則通過(guò)Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養(yǎng)的形態(tài)特征來(lái)鑒定。另外，還可以應(yīng)用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗(yàn)等試驗(yàn)來(lái)輔助鑒定。

檢驗(yàn)地帶網(wǎng)

霉菌的鑒定非常復(fù)雜，有許多標(biāo)準(zhǔn)包括形態(tài)學(xué)特征、溫度耐受性，放線菌酮抗性、雙相性、營(yíng)養(yǎng)需求、蛋白分解活動(dòng)以及水解尿素能力等。現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)鑒定方法主要 依據(jù)分生孢子的個(gè)體發(fā)生過(guò)程結(jié)合其他特征來(lái)進(jìn)行鑒定。初代培養(yǎng)后根據(jù)形態(tài)學(xué)特征一般可鑒定到屬的水平，再依據(jù)不同真菌的鑒定要求，采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件進(jìn)一步完成菌種鑒定。例如：曲霉屬鑒定時(shí)需要采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，即察氏培養(yǎng)基和麥芽瓊脂，25℃培養(yǎng)7天后與曲霉形態(tài)鑒定檢索表對(duì)應(yīng)得到正確的結(jié)果。

2.怎樣檢測(cè)環(huán)境中的細(xì)菌和真菌

1、選取五套培養(yǎng)皿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一個(gè)做為對(duì)比，另外四個(gè)用來(lái)培養(yǎng)不同環(huán)境中的細(xì)菌，并且是在不同的環(huán)境中培養(yǎng)，以便得出細(xì)菌和真菌的生存條件。

2、培養(yǎng)皿經(jīng)過(guò)高溫滅菌，準(zhǔn)備至少5套培養(yǎng)皿。因?yàn)閷?duì)比不同環(huán)境中的細(xì)菌與真菌的存在情況，是屬于單因素比較，所以除了采樣地點(diǎn)是變量外，進(jìn)行微生物培養(yǎng)的條件等也要保持一致

3、經(jīng)過(guò)高溫處理后可以將培養(yǎng)皿上、培養(yǎng)基內(nèi)混有的細(xì)菌或真菌的孢子等殺死（經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的高溫滅菌的環(huán)境中是不可能有細(xì)菌和真菌存在的），這樣就排除了實(shí)驗(yàn)外其他環(huán)境的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)前不要盲目的打開(kāi)培養(yǎng)皿，以防止細(xì)菌或真菌的孢子等落在培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)中用無(wú)菌棉棒的目的同樣是為了防止棉棒上的微生物污染培養(yǎng)基。

4、在不同的環(huán)境中細(xì)菌的分布是不相同的，因此在采集菌種的時(shí)候要注意選擇環(huán)境，做到要有一定的代表性。

5、接種好的培養(yǎng)基要放在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

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3.曲霉菌感染檢測(cè)方法有哪些

GM抗原的檢測(cè)目前最主流的方法是經(jīng)典的一步法酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，目前國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的檢測(cè)產(chǎn)品是由美國(guó)Bio-Rad公司提供的曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒（），可快速、靈敏的發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的GM抗原，幫助臨床實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)曲霉菌感染。

GM抗原是曲霉菌半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原的簡(jiǎn)稱(chēng)，是曲霉菌胞壁的組成成分，在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中可釋放人血液，檢測(cè)患者血清中GM抗原水平有助于侵襲性曲霉菌?。↖nvasive Aspergillosis, IA）的早期診斷。推薦首次檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)一般為當(dāng)臨床懷疑患者發(fā)生IA時(shí)，或者需要對(duì)免疫妥協(xié)患者進(jìn)行常規(guī)篩查時(shí)。1另外，對(duì)于開(kāi)始進(jìn)行抗真菌治療的患者，推薦進(jìn)行每周兩次的GM水平監(jiān)測(cè)，以幫助判斷臨床療效及患者預(yù)后。2

由于血清學(xué)試驗(yàn)為間接檢測(cè)手段，除外檢測(cè)試劑盒的選擇，感染曲霉菌類(lèi)型、宿主本身、以及使用的診斷標(biāo)準(zhǔn)和方法等，都可能影響檢測(cè)結(jié)果。所以在檢測(cè)過(guò)程中，需要注意各種影響的因素，以盡可能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性而干擾了最終的臨床診斷，延誤患者診治。在不考慮檢測(cè)者本身操作原因及試驗(yàn)環(huán)境污染等因素的前提下，我們來(lái)了解下哪些因素可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果：3

生物學(xué)因素：

· 感染部位（比如鼻竇，肺部，還是播散性）

· 感染部位的微環(huán)境（比如營(yíng)養(yǎng)，氧含量，PH值）

· 曲霉菌種類(lèi)

· 是否使用抗真菌藥物

· 釋放的GM抗原分子結(jié)構(gòu)

· 患者免疫抑制的程度

· 腎臟清除率，肝代謝情況

· 患者體內(nèi)是否存在GM抗體

· 樣本的保存條件及時(shí)間

· 患者檢測(cè)前的治療情況

流行病學(xué)因素：

· 患者所屬人群

· 當(dāng)?shù)馗腥玖餍新?/p>

· 樣本采集手段

· Cut-off值的設(shè)定

· 感染患者的界定標(biāo)準(zhǔn)

· 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)

由于對(duì)結(jié)果的影響因素眾多，為了確保最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇高質(zhì)量的檢測(cè)試劑盒就顯得至關(guān)重要，即便選擇了值得信賴(lài)的檢測(cè)產(chǎn)品，操作者在分析GM抗原檢測(cè)結(jié)果時(shí)，還是需要結(jié)合各種客觀的影響因素，為臨床提供最為準(zhǔn)確可性的報(bào)告。

4.病原微生物中細(xì)菌常見(jiàn)檢測(cè)方法有哪些

細(xì)菌 [what]什么是細(xì)菌？細(xì)菌（英文：germs;bacteria）隸屬生物學(xué)一類(lèi)，是在自然界分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。

細(xì)菌主要由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)體等部分構(gòu)成，有的細(xì)菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)細(xì)菌的直徑大小在0.5~5μm之間。

可根據(jù)形狀分為三類(lèi)，即：球菌、桿菌和螺旋菌（包括弧形菌）。 還有一種利用細(xì)菌的生活方式來(lái)分類(lèi)，即可分為兩大類(lèi)：腐生生活與寄生生活。

（一）細(xì)胞壁 細(xì)胞壁厚度因細(xì)菌不同而異，一般為15-30nm。主要成分是肽聚糖，由n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸構(gòu)成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。

n-乙酰胞壁酸分子上有四肽側(cè)鏈，相鄰聚糖纖維之間的短肽通過(guò)肽橋（革蘭氏陽(yáng)性菌）或肽鍵（革蘭氏陰性菌）橋接起來(lái)，形成了肽聚糖片層，像膠合板一樣，粘合成多層。 肽聚糖中的多糖鏈在各物種中都一樣，而橫向短肽鏈卻有種間差異。

革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁厚約20~80nm，有15-50層肽聚糖片層，每層厚1nm，含20-40%的磷壁酸（teichoic acid），有的還具有少量蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，其他成分較為復(fù)雜，由外向內(nèi)依次為脂多糖、細(xì)菌外膜和脂蛋白。

此外，外膜與細(xì)胞之間還有間隙。 肽聚糖是革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的主要成分，凡能破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)或抑制其合成的物質(zhì)，都有抑菌或殺菌作用。

如溶菌酶是n-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制轉(zhuǎn)肽酶的活性，抑制肽橋形成。 細(xì)菌細(xì)胞壁的功能包括：保持細(xì)胞外形；抑制機(jī)械和滲透損傷（革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁能耐受20kg/cm2的壓力）；介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；協(xié)助細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分裂。

脫壁的細(xì)胞稱(chēng)為細(xì)菌原生質(zhì)體（bacterial protoplast）或球狀體（spheroplast，因脫壁不完全），脫壁后的細(xì)菌原生質(zhì)體，生存和活動(dòng)能力大大降低。 （二）細(xì)胞膜 是典型的單位膜結(jié)構(gòu)，厚約8~10nm，外側(cè)緊貼細(xì)胞壁，某些革蘭氏陰性菌還具有細(xì)胞外膜。

通常不形成內(nèi)膜系統(tǒng)，除核糖體外，沒(méi)有其它類(lèi)似真核細(xì)胞的細(xì)胞器，呼吸和光合作用的電子傳遞鏈位于細(xì)胞膜上。某些行光合作用的原核生物（藍(lán)細(xì)菌和紫細(xì)菌），質(zhì)膜內(nèi)褶形成結(jié)合有色素的內(nèi)膜，與捕光反應(yīng)有關(guān)。

某些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌質(zhì)膜內(nèi)褶形成小管狀結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為中膜體（mesosome）或間體（圖3-11），中膜體擴(kuò)大了細(xì)胞膜的表面積，提高了代謝效率，有擬線粒體（chondroid）之稱(chēng)，此外還可能與dna的復(fù)制有關(guān)。 （三）細(xì)胞質(zhì)與核質(zhì)體 細(xì)菌和其它原核生物一樣，沒(méi)有核膜，dna集中在細(xì)胞質(zhì)中的低電子密度區(qū)，稱(chēng)核區(qū)或核質(zhì)體（nuclear body）。

細(xì)菌一般具有1-4個(gè)核質(zhì)體，多的可達(dá)20余個(gè)。核質(zhì)體是環(huán)狀的雙鏈dna分子，所含的遺傳信息量可編碼2000~3000種蛋白質(zhì)，空間構(gòu)建十分精簡(jiǎn)，沒(méi)有內(nèi)含子。

由于沒(méi)有核膜，因此dna的復(fù)制、rna的轉(zhuǎn)錄與蛋白的質(zhì)合成可同時(shí)進(jìn)行，而不像真核細(xì)胞那樣這些生化反應(yīng)在時(shí)間和空間上是嚴(yán)格分隔開(kāi)來(lái)的。 每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞約含5000~50000個(gè)核糖體，部分附著在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，大部分游離于細(xì)胞質(zhì)中。

細(xì)菌核糖體的沉降系數(shù)為70s，由大亞單位（50s）與小亞單位（30s）組成，大亞單位含有23srrna,5srrna與30多種蛋白質(zhì)，小亞單位含有16srrna與20多種蛋白質(zhì)。30s的小亞單位對(duì)四環(huán)素與鏈霉素很敏感，50s的大亞單位對(duì)紅霉素與氯霉素很敏感。

細(xì)菌核區(qū)dna以外的，可進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳因子，稱(chēng)為質(zhì)粒（plasmid）。質(zhì)粒是裸露的環(huán)狀雙鏈dna分子，所含遺傳信息量為2~200個(gè)基因，能進(jìn)行自我復(fù)制，有時(shí)能整合到核dna中去。

質(zhì)粒dna在遺傳工程研究中很重要，常用作基因重組與基因轉(zhuǎn)移的載體。 胞質(zhì)顆粒是細(xì)胞質(zhì)中的顆粒，起暫時(shí)貯存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用，包括多糖、脂類(lèi)、多磷酸鹽等。

（四）其他結(jié)構(gòu) 許多細(xì)菌的最外表還覆蓋著一層多糖類(lèi)物質(zhì)，邊界明顯的稱(chēng)為莢膜（capsule），如肺炎球菌，邊界不明顯的稱(chēng)為粘液層（slime layer），如葡萄球菌。莢膜對(duì)細(xì)菌的生存具有重要意義，細(xì)菌不僅可利用莢膜抵御不良環(huán)境；保護(hù)自身不受白細(xì)胞吞噬；而且能有選擇地粘附到特定細(xì)胞的表面上，表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞的專(zhuān)一攻擊能力。

例如，傷寒沙門(mén)桿菌能專(zhuān)一性地侵犯腸道淋巴組織。細(xì)菌莢膜的纖絲還能把細(xì)菌分泌的消化酶貯存起來(lái)，以備攻擊靶細(xì)胞之用。

鞭毛是某些細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，由一種稱(chēng)為鞭毛蛋白（flagellin）的彈性蛋白構(gòu)成，結(jié)構(gòu)上不同于真核生物的鞭毛。細(xì)菌可以通過(guò)調(diào)整鞭毛旋轉(zhuǎn)的方向（順和逆時(shí)針）來(lái)改變運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。

菌毛是菌體表面極其的蛋白纖細(xì)，須用電鏡觀察。特點(diǎn)是：細(xì)、短、直、硬、多，菌毛與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)，根據(jù)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，可分為普通菌毛和性菌毛兩類(lèi)。

前者與細(xì)菌吸附和侵染宿主有關(guān)，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質(zhì)有關(guān)。 （五）繁殖 細(xì)菌一二分裂的方式繁殖，某些細(xì)菌處于不利的環(huán)境，或耗盡營(yíng)養(yǎng)時(shí)，形成內(nèi)生孢子，又稱(chēng)芽孢，是對(duì)不良環(huán)境有強(qiáng)抵抗力的休眠體，由于芽胞在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成，故常稱(chēng)為內(nèi)生孢子。

芽孢的生命力非常頑強(qiáng)，有些湖底沉積土中的芽抱桿茵經(jīng)500-1000年后仍有活力，肉毒梭菌的芽孢在ph 7.0時(shí)能耐受100℃煮沸5-9.5小。