單孢分離法的(黑木耳的分離單孢方法是什么?)

1.黑木耳的分離單孢方法是什么?

分離單孢的方法很多，有平板稀釋法、平板劃線分離法、稀釋涂布法、液滴分離法、毛細(xì)管分離法等。

我們采用的是平 板稀釋法，即將收集到的木耳孢子用無(wú)菌水稀釋至合適濃度， 將孢子懸液接入平皿中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后挑取大量單菌落， 接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中插有蓋玻片。菌絲萌 發(fā)后取出玻片一一鏡檢，將無(wú)鎖狀聯(lián)合的單核菌絲編上號(hào)作 雜交材料。

將兩個(gè)不同親本經(jīng)鏡檢無(wú)鎖狀聯(lián)合的單核菌絲A, B分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基試管的上下部，待兩 單核菌絲生長(zhǎng)相遇時(shí)，取連接處的一小塊菌絲（經(jīng)鏡檢有鎖狀 聯(lián)合者即為雜交菌絲C）接種于另一空白培養(yǎng)基試管中央，在 它的上下部分別接兩個(gè)親本菌絲A和B，觀察雜交菌絲C與 親本菌絲A,B有無(wú)拮抗線。如有明顯的拮抗線，即表示該配 對(duì)為雜交菌絲，則保留；沒有拮抗線而長(zhǎng)到一起的不是雜交菌 絲，則淘汰。

2.草菇單孢分離法育種方法是什么?

單孢分離是一種可以獲得純菌種的方法，主要就是將采集到的孢子群分開培養(yǎng)，讓它們單獨(dú)萌發(fā)成菌絲。

通過對(duì)草菇進(jìn)行有性分離育種，然后選育出草菇菌株。表明草菇的孢子分離菌株，不管是在菌絲形態(tài)，還是生長(zhǎng)速度和產(chǎn)厚垣孢子的能力方面，以及出菇率和產(chǎn)量等性狀上都存在比較大的差異。

我們可以在菌絲生長(zhǎng)比較濃密的地方及能產(chǎn)生大量厚垣孢子的菌株中，選擇到產(chǎn)量較高的菌株在生產(chǎn)中應(yīng)用，可以在一定程度上解決草菇生產(chǎn)上出現(xiàn)的菌種老化、退化問題。單孢分離法主要的步驟：菇種的選擇首先是對(duì)藤種進(jìn)行選擇，并進(jìn)行一系列的消毒處理。

努力收集質(zhì)量比較好的單孢子。 單孢子的分離和涂布選擇一種適合自己的方法獲得單孢子，并對(duì)單孢子進(jìn)行分離，單孢子的分離可采用單孢子分離器法和平板劃線分離法。

然后進(jìn)行孢子涂布，在滅菌培養(yǎng)基上把獲得的單孢子均勻涂開。單孢子培養(yǎng)在保持溫度大約在35℃-40℃恒溫下，把單孢子培養(yǎng)至長(zhǎng)成純菌絲，然后按可育性菌株的培養(yǎng)特征，把符合條件的菌株留作母種。

擴(kuò)大母種把培養(yǎng)好的單孢子擴(kuò)大培養(yǎng)成原種和生產(chǎn)種。出菇測(cè)驗(yàn)把母種培養(yǎng)成原種和生產(chǎn)種后，就要開始對(duì)出菇進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，把出菇早、出菇均勻、粒大、菇形好、產(chǎn)量高的菌種篩選保留。

選擇一小塊試驗(yàn)田進(jìn)行試種，檢驗(yàn)出菇率的穩(wěn)定性。小面積試種成功后，就可擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)田的面積，繼續(xù)進(jìn)行出菇率的確認(rèn)。

最后就是把經(jīng)過確認(rèn)的菇種，大面積推廣應(yīng)用。

3.菌種孢子分離應(yīng)怎樣操作

孢子分離為有性繁殖，所獲菌種已經(jīng)發(fā)生遺傳重組等變 異，生產(chǎn)性狀有可能優(yōu)于母體，也有可能劣于母體。

孢子分 離有單孢分離和多孢分離兩種方法，單孢分離主要用于遺傳育種研究，多孢分離多用于生產(chǎn)繁種。孢子分離技術(shù)如下：懸菇彈孢法：采集剛彈射孢子的子實(shí)體菌蓋，在無(wú)菌室經(jīng)消毒處理 后，將菌褶朝下懸吊于無(wú)菌容器內(nèi)收集孢子，在22度?26°度 下讓其自然彈射孢子5?10小時(shí)，容器底部出現(xiàn)白色孢子 印。

取無(wú)菌水粘取少量孢子制成孢子懸浮液，用滅過菌的注射器或滴管吸取孢子懸浮液，滴1?2滴于試管斜面上，經(jīng) 25°度培養(yǎng)至孢子萌發(fā)，挑選無(wú)污染的斜面進(jìn)行擴(kuò)繁，經(jīng)過嚴(yán) 格的出菇試驗(yàn)，擇優(yōu)用于生產(chǎn)。褶片粘貼法：在無(wú)菌條件下，選取一小塊子實(shí)體組織，蘸少量無(wú)菌瓊 脂或漿糊，粘附于試管培養(yǎng)基斜面的對(duì)面玻壁上，加棉塞后 在20度左右靜置，菌孔組織中的孢子會(huì)彈射到斜面培養(yǎng)基 上，再去掉試管壁上的菌塊，進(jìn)一步培養(yǎng)獲得多孢子萌發(fā)的 菌絲體。

4.什么是孢子分離法

孢子分離法也稱為孢子彈射分離法，是利用某些藥用真菌子實(shí)體成熟后自行彈射孢子的特性，在無(wú)菌條件下，使彈射的孢子落到適宜培養(yǎng)基上，在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，孢子萌發(fā)成菌絲，從而獲得純菌種的一種方法。

（1） 分離材料的選擇與消毒孢子分離材料，來(lái)自于多年人工栽培的優(yōu)良品系和野生的種菇。 在同一個(gè)生長(zhǎng)條件下，栽培同一種藥用真菌不同的品系，其生產(chǎn)效益和品質(zhì)有很大差異；而同一個(gè)品系栽培在不同的環(huán)境條件下，其優(yōu)良性狀表現(xiàn)也不同，就是在相同環(huán)境條件下栽培的同一個(gè)品系，其單株之間也會(huì)出現(xiàn)差異。

因此，應(yīng)選擇長(zhǎng)期栽培的優(yōu)良品種的優(yōu)良單株作為分離材料。 野生的菌株，未經(jīng)過人工栽培，不知其優(yōu)良性狀、抗逆能力和生產(chǎn)性能如何，只能作為育種搜集原始材料時(shí)進(jìn)行孢子分離，經(jīng)過培養(yǎng)品系之間對(duì)比試驗(yàn)，選擇優(yōu)良者進(jìn)行生產(chǎn)，在選優(yōu)去劣的培養(yǎng)過程中，再在群體中選擇優(yōu)良個(gè)體，作為孢子分離的材料。

理想的種菇應(yīng)該是具有該品種主要典型的特征，發(fā)育正常，個(gè)體健壯，無(wú)病蟲害，成熟適度的子實(shí)體。 種菇選定后，可將其周圍 10厘米左右范圍內(nèi)的小菇全部摘除，適當(dāng)增加噴水量，有的藥用真菌子實(shí)體有菌幕包著，即可待種菇有八、九分成熟時(shí)，及時(shí)采摘進(jìn)行消毒。

可剪去菌柄的三分之二，用清水洗去黏附的污物，浸入0。 1%的升汞溶液中1~2分鐘或在70%的酒精中浸幾秒到1分鐘，取出后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗數(shù)次，用滅菌的紗布或?yàn)V紙吸干表面水分后待用。

有些藥用菌如香菇的子實(shí)體，很小時(shí)菌幕就被拉開；或有的種類根本無(wú)菌幕，菌褶裸露于空氣中，很難避免有雜菌孢子附著在菌褶上，則應(yīng)采摘成熟的子實(shí)體，剪去三分之二的菌柄，用 75%的酒精揩擦菌蓋及菌柄表面，并在插人孢子收集器后6~12小時(shí)內(nèi)，種菇孢子已彈出而附在上面的雜菌孢子短時(shí)間內(nèi)還未脫落時(shí)取出子實(shí)體。 而對(duì)于膠質(zhì)菌類的子實(shí)體，只能用無(wú)菌水洗滌，用無(wú)菌紗布吸干表面水分后待用。

（2） 孢子的采集種菇經(jīng)消毒處理后，即可采用以下方法收集孢子。孢子彈射采集法：利用孢子自動(dòng)彈射出子實(shí)層的特性，采集孢子。

一般采用整株插種法、三角瓶鉤懸法和試管貼附法，全部操作過程都應(yīng)該在無(wú)菌條件下進(jìn)行。 ① 整株插種法：適于傘菌類孢子的采集。

首先應(yīng)準(zhǔn)備好孢子采集器，用搪瓷盤或大于鐘罩的培養(yǎng)皿作底盤，上面放一個(gè)小培養(yǎng)皿，皿內(nèi)放一個(gè)不銹鋼的支架，用鐘罩蓋在小培養(yǎng)皿上，將整套孢子采集器用雙層紗布或報(bào)紙包好，經(jīng)高壓滅菌后備用。在無(wú)菌條件下打開孢子采集器，揭去鐘罩，為了防止鐘罩與培養(yǎng)皿接觸處雜菌侵人和增加采集器內(nèi)部的濕度，在大培養(yǎng)皿內(nèi)鋪 2~3層滅菌的紗布或脫脂棉，倒人0。

1 %的升汞液，以浸濕紗布為度，然后放人小培養(yǎng)皿，將消毒后的子實(shí)體插在支架上蓋鐘罩后，根據(jù)不同分離對(duì)象，移至18~25°C條件下，培養(yǎng)6小時(shí)至2天，待小皿內(nèi)彈射并沉積一層孢子后，移入無(wú)菌室，先用75%的酒精或0。1%升汞擦拭鐘罩外部，打開鐘罩取出子實(shí)體，小培養(yǎng)皿加蓋密封，供分離用。

② 三角瓶鉤懸法：適用于不具菌柄子實(shí)體孢子的采集，如膠質(zhì)菌銀耳、木耳等。在無(wú)菌條件下，將耳片用無(wú)菌水沖洗數(shù)次后，用無(wú)菌紗布吸干水分，將耳片掛在金屬鉤上，鉤子的另一端掛在三角瓶口上，瓶?jī)?nèi)裝有PDA培養(yǎng)基，加棉塞，置25°C溫度下培養(yǎng) 1~2天，當(dāng)培養(yǎng)基表面有一層孢子粉時(shí)，把三角瓶拿到無(wú)菌室取出耳片和鉤子，仍塞好棉塞繼續(xù)培養(yǎng)。

③ 貼附法：取一塊經(jīng)消毒的成熟菌褶或耳片，用滅菌的瓊脂或漿糊，黏附在裝有PDA培養(yǎng)基的試管斜面或培養(yǎng)皿皿蓋正上方，加棉塞或蓋皿蓋后置室溫下培養(yǎng)，待孢子自然落下后，在無(wú)菌室內(nèi)懾除菌褶或耳片，或?qū)⒙溆墟咦拥呐囵B(yǎng)基轉(zhuǎn)移在新的試管斜面及培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)基上，加塞或加蓋后繼續(xù)培養(yǎng)。 ④ 孢子印采集法：取成熟的子實(shí)體經(jīng)表面消毒后，切去菌柄，置于滅過菌的白色或黑色蠟光紙上，罩上通氣鐘罩，在24°C下靜置數(shù)小時(shí)后，輕輕移去種菇，可見有大量孢子落在紙上。

將有孢子印的紙?jiān)跓o(wú)菌條件下保存?zhèn)溆?。?菌褶涂抹法：在接種室內(nèi)，將成熟的子實(shí)體表面消毒，去掉菌柄，用消毒的接菌環(huán)插入兩片菌褶之間，輕輕涂抹褶片，將尚未彈射的孢子沾在接種環(huán)上，然后用劃線法接種在準(zhǔn)備好的斜面培養(yǎng)基上或平板培養(yǎng)基上。

操作時(shí)，要嚴(yán)格在無(wú)菌條件下，動(dòng)作要準(zhǔn)確。⑥ 空中孢子捕捉法：傘菌子實(shí)體成熟后，孢子大量彈射，在子實(shí)體周圍可見煙霧狀的“孢子云”，將準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板或試管口迎著“孢子云”方向，使孢子附著在培養(yǎng)基表面，隨即蓋上皿蓋或加棉塞即可。

（3） 孢子的分離采集到的孢子，一般需要經(jīng)過分離選擇后，才能制作原種。 孢子的分離根據(jù)接種到培養(yǎng)基上的孢子數(shù)量而分單孢分離和多孢分離兩種。

有些菇類的孢子，具有單孢結(jié)菇的能力，可采用單孢分離純菌種的方法；有些種類如香菇、木耳、金針菇等藥用真菌的單孢菌絲，只有經(jīng)過質(zhì)配后才能結(jié)菇，多采用多孢分離法，多孢分離方法簡(jiǎn)單、易操作、沒有不孕現(xiàn)象，在生產(chǎn)上常采用；但不能選擇優(yōu)良單孢繁殖后代，如果進(jìn)行雜交育種時(shí)，仍應(yīng)進(jìn)行單孢分離。 單孢分離：從采集到的孢子群中，挑出單個(gè)孢子進(jìn)行培養(yǎng)，單。