pcr加樣(PCR加樣有什么需要注意的?)

1.PCR加樣有什么需要注意的?

實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：

1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；

5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；

6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；

7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；

8. 重復實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。

2.我想問做PCR擴增應該注意的事項?

注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質(zhì)污染，影響比值 2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 總mRNA的提?。ㄗ约旱慕?jīng)驗） 一、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑 1. Chloroform：氯仿 （分析純） 2. Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純） 3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。

要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。 4. RNase-free water：無Rnase的水。

方法是：將DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul)，在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時） 5. 一次性塑料手套 6. 注意：DEPC有致癌之嫌 二、關(guān)于Trizol Reagent的使用過程： 1. Homogenization（勻漿） a. Tissues：組織 每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。 b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒后出現(xiàn)病變的） 針對JEV細胞總RNA的抽提法： BHK21細胞長成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。

出 現(xiàn)75%-100%的病變時，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩 種常用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據(jù)細胞的數(shù)量，否則可導致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮） （1） 組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白復合物徹底分離。

（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。 （3） 4℃離心，10000g*15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。

RNA包含在水相中，水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%。 (4) 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。

（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。 (6) 4℃離心，10000g*10min。

RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。 （7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g*5min。

棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA,-70℃保存?zhèn)溆谩?（8） 抽提出的細胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。

于0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結(jié)果應為：A260/280 ratio。

3.PCR實驗過程中的注意事項

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。

提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。

RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。

在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100~300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。

若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度； 5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管； 6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)； 8. 重復實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。

4.PCR擴增需要注意的點

1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區(qū)域的同源性應小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴格的限制，故引物設(shè)計時可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會影響反應產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。

2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實驗室）。

3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應體系中應適當調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。

4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過低則會導致反應速度下降。使用時4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。

5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。

6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學試劑分開放置；②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產(chǎn)物分析三個工作區(qū)的獨立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實驗的所有反應試劑；⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實驗；⑥制備樣品、配制試劑及反應液時必須戴手套；⑦實驗前一定要認真清潔加樣器等。

5.在PCR擴增實驗中應注意什么

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。

在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。

需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。

有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。

如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。

④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。

需重新設(shè)計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。

這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。

所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。

二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。

其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。

其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。

適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。