培養(yǎng)基滅菌要(培養(yǎng)基的制備與滅菌的實驗中配制培養(yǎng)基時要注意哪些問題)
1.培養(yǎng)基的制備與滅菌的實驗中配制培養(yǎng)基時要注意哪些問題
1、常用玻璃儀器的準備 制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理，也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養(yǎng)基的制備及儲存 （1）溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi).加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補足水分.在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞.（2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H.因此測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃.調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定，并記下每次pH的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié).干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH，用時也必須再驗證.測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清.（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經(jīng)校準和確認.每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管.固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用.分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)最佳）進行滅菌處理.液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定.普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應(yīng)延長至20min.含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過濾器，過濾除菌.高壓滅菌應(yīng)嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時間，達到全部殺滅微生物.以上的滅菌時間和溫度要經(jīng)過驗證確認，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。
2.培養(yǎng)基消毒需要注意什么?
滅菌培養(yǎng)基配制過程中，所用的玻璃器皿要洗滌干凈，不能帶 有雜質(zhì)。
可先用清水沖洗，再浸人洗衣粉液中浸泡，用刷子內(nèi) 外刷洗，沖凈，再用蒸餾水沖洗1 ~2次，放人150°C的烘箱 中，干熱滅菌1小時后備用。吸管、量筒等難以洗滌的要先放 人洗液中浸泡2小時，再用清水沖洗。
培養(yǎng)基的消毒、滅菌，一般采用高壓蒸氣鍋蒸10 ~20分 鐘。在培養(yǎng)基消毒、滅菌時，可把接種植物材料用的蒸餾水盛 入三角瓶中，用棉塞塞緊，牛皮紙包裹瓶口，再用橡皮筋捆扎。
將懾子、剪刀、刀子等用具用布墊包裹或放人鋁制飯盒中，與 培養(yǎng)基一起放人高壓鍋中消毒。培養(yǎng)基消毒后取出放人搪瓷 盤中，將盤子放入平坦的桌面上，讓培養(yǎng)基冷卻、凝固。
3.培養(yǎng)基的滅菌方法有哪些
培養(yǎng)基的滅菌方法1、高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。
培養(yǎng)基在愛制備過程中混入各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)在24h內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時一般是在0。
105MPa壓力下，溫度121℃時，滅菌15~30min即可。 消毒時間不宜過長，也不能超過規(guī)定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類物質(zhì)就會在高溫下分解，失去營養(yǎng)作用，也會使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。
將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。 滅菌后的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)3d，若無污染現(xiàn)象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。
暫時不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養(yǎng)基應(yīng)在1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不要超過1個月。
2、過濾滅菌：一些植物生長調(diào)節(jié)劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進行高溫滅菌，而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。 細菌過濾器與濾膜（孔徑0。
45微米）使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
4.培養(yǎng)基的滅菌流程
原理 培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。
由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。
瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98~100℃下融化，于45℃以下凝固。
但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。
一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。3材料3.1器皿及材料 天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。
3.2藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。4流程 稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。
5步驟5.1培養(yǎng)基的制備5.1.1稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。
5.1.2溶解 用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。
如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。5.1.3調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。
測定pH可用pH試紙或酸度計等。5.1.4溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。
瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預(yù)熱）。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。
5.1.5過濾分裝 先將過濾裝置安裝好（圖3-1）。如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進行過濾。
過濾后立即進行分裝。分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。
液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。
5.1.6包扎標記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。
5.1.7滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。
培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面（圖3-2），斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。5.1.8倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45~50℃，立刻倒平板。
5.2滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。
蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。
5.2.1.高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。
當(dāng)蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15~30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌（圖3-4）。
5.2.1.1操作方法和注意事項如下 加水 打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋最好用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。
注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。
排氣 打開排氣口（也叫放氣閥）。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。
升壓、保壓和降壓 當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣。
5.微生物實驗中培養(yǎng)基的配置應(yīng)該注意什么
1、常用玻璃儀器的準備 制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理，也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養(yǎng)基的制備及儲存 （1）溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi).加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補足水分.在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞.（2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H.因此測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃.調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定，并記下每次pH的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié).干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH，用時也必須再驗證.測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清.（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經(jīng)校準和確認.每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管.固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用.分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)最佳）進行滅菌處理.液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定.普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應(yīng)延長至20min.含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過濾器，過濾除菌.高壓滅菌應(yīng)嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時間，達到全部殺滅微生物.以上的滅菌時間和溫度要經(jīng)過驗證確認，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。
6.在微生物培養(yǎng)中,對培養(yǎng)基常用什么法進行滅菌
培養(yǎng)基的滅菌方法
1、高壓蒸汽滅菌：
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養(yǎng)基在愛制備過程中混入各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)在24h內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時，滅菌15~30min即可。消毒時間不宜過長，也不能超過規(guī)定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類物質(zhì)就會在高溫下分解，失去營養(yǎng)作用，也會使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。 滅菌后的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng)3d，若無污染現(xiàn)象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養(yǎng)基應(yīng)在1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不要超過1個月。
2、過濾滅菌：
一些植物生長調(diào)節(jié)劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進行高溫滅菌，而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。細菌過濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
