A、探究果膠酶的最適溫度時,需將底物和酶分別在同等溫度下處理后再混合,目的是控制單一變量,而無關變量要相同且適宜.故A對.
B、高溫、過酸、過堿都會破壞酶的空間結構使酶失活,酶的活性不能恢復.低溫使酶失活,但沒有破壞酶的空間結構,酶的活性可以恢復.故B錯.
C、酶作為催化劑在化學反應前后本身的性質、數(shù)量不變,發(fā)揮作用后還留在產物中.在探究果膠酶的最適溫度和最適PH實驗中,為了不影響后續(xù)反應的進行,待酶作用完后立即煮沸失活.故C對.
D、間接之間用氫鍵連接,解旋酶是一類解開氫鍵的酶.故D對.
故選:B.
1.底物濃度 除選擇適合的底物外,在實際應用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應速度V成雙曲線關系,在酶活性測定時,要求[S]達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜,此時反應速度基本達到最大反應速度,測定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應條件一定時,酶濃度與反應速度成正比。按照中間產物學說,只有[S]>>[E]時,酶才能被底物分子飽和,反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過高時,應將標本適當稀釋后再加以測定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同,多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃,高于或低于最適溫度,酶活性都降低。目前,酶活性的測定溫度尚未統(tǒng)一,但常規(guī)實驗室多使用37℃。溫度對酶促反應的影響程度通常用溫度系數(shù)(Q10)表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃,化學反應速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知,溫度的變化對酶活性有著重要影響,因此要求酶活性測定要在恒溫條件下進行,溫度波動要控制在±1℃。
4.離子強度和pH值 在最適pH時,酶的活性最強,高于或低于最適pH,酶的活性都降低,多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測定酶活性時,要求緩沖液具有足夠的緩沖容量,以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標本含有多種緩沖溶質,具有較強的緩沖能力。為了防止血漿或血清標本緩沖溶質對反應液酸堿度的影響,使pH不致偏離設定值,標本用量不宜過大,血漿或血清標本體積/反應液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結合酶的輔助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的輔基,Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基,NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性,因此在酶活性測定時,就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時才有活性或活性較高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑,Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測定時,也要滿足酶對激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬于不可逆抑制;丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的抑制屬于競爭性抑制;哇巴因對Na+,K+-ATP酶的抑制屬于非競爭性抑制。抑制劑使酶活性降低,在測定酶活性時,應避免抑制劑的影響。
綜上所述,測定酶活性時,最適條件的選擇應該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
1.底物濃度 除選擇適合的底物外,在實際應用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應速度V成雙曲線關系,在酶活性測定時,要求[S]達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜,此時反應速度基本達到最大反應速度,測定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應條件一定時,酶濃度與反應速度成正比。按照中間產物學說,只有[S]>>[E]時,酶才能被底物分子飽和,反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過高時,應將標本適當稀釋后再加以測定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同,多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃,高于或低于最適溫度,酶活性都降低。目前,酶活性的測定溫度尚未統(tǒng)一,但常規(guī)實驗室多使用37℃。溫度對酶促反應的影響程度通常用溫度系數(shù)(Q10)表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃,化學反應速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知,溫度的變化對酶活性有著重要影響,因此要求酶活性測定要在恒溫條件下進行,溫度波動要控制在±1℃。
4.離子強度和pH值 在最適pH時,酶的活性最強,高于或低于最適pH,酶的活性都降低,多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測定酶活性時,要求緩沖液具有足夠的緩沖容量,以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標本含有多種緩沖溶質,具有較強的緩沖能力。為了防止血漿或血清標本緩沖溶質對反應液酸堿度的影響,使pH不致偏離設定值,標本用量不宜過大,血漿或血清標本體積/反應液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結合酶的輔助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的輔基,Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基,NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性,因此在酶活性測定時,就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時才有活性或活性較高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑,Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測定時,也要滿足酶對激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬于不可逆抑制;丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的抑制屬于競爭性抑制;哇巴因對Na+,K+-ATP酶的抑制屬于非競爭性抑制。抑制劑使酶活性降低,在測定酶活性時,應避免抑制劑的影響。
綜上所述,測定酶活性時,最適條件的選擇應該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
酶的活性測定要求有適宜的特定反應條件,應注意影響酶促反應速度的各種因素應該相對恒定。
1.酶的樣品應做適當?shù)奶幚怼?.反應體系中,底物的量足夠使酶被底物飽和,以充分反映待測酶的活力。
但過高的底物濃度可能抑制酶的活性,一般底物濃度在10km以上。3.測定代謝物時應保持酶的足夠濃度。
4.應根據反應時間選擇反應的最適溫度。5.根據不同的底物和緩沖液選擇反應的最適pH。
6.為獲取最高反應速度,在反應體系中應含有適宜的輔助因子,激活劑等。7.測定酶活性時應測定酶促反應的初速度。
果膠酶活性的檢測
[目的]
本檢測方法是用來果膠酶的催化活性。本方法適用于各種固體和液體果膠酶制劑。
[說明]
本方法適合于果膠酶的質量分析和質量控制領域。但不是本公司產品及其它公司產品的絕對活力的預測,而各種酶制劑的最終的酶活力在良好的實驗操作下仍可發(fā)揮出更好的催化活力。
[原理]
果膠物質主要存在于植物初生壁和細胞中間,果膠物質是細胞壁的基質多糖。果膠包括兩種酸性多糖(聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸)和三種中性多糖(阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖)。果膠酶本質上是聚半乳糖醛酸水解酶,果膠酶水解果膠主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸鈉法進行半乳醛酸的定量,從而測定果膠酶活力。
[果膠酶活力單位定義]
1g(或1ml液體酶)酶粉,于50.0℃、pH3.5條件下,每分鐘催化果膠水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量為一個活力單位。
1. 試劑和儀器
*本標準所使用所有的試劑若無任何說明,均為分析純
1.1 醋酸
1.2 碘
1.3 碘花鉀
1.4 濃硫酸
1.5 果膠(sigma公司)
1.6 硫代硫酸鈉
1.7 碳酸鈉
1.8 可溶性淀粉
1.9 水浴鍋
1.10 碘量瓶
2. 試劑的制備
2.1 pH3.5的酸水
用醋酸將蒸餾水調至3.5
2.2 1%果膠溶液:
準確稱取分析純果膠1g,用酸水溶解煮沸,冷卻后過濾,定至100ml。
2.2 0.1N碘液:
準確稱取碘化鉀5g,用蒸餾水溶解后,加入2.54g碘,溶解后定容至100ml。
2.3 0.025mol/L硫代硫酸鈉:
準確稱取6.2g硫代硫酸鈉,加蒸餾水后定容至1L
2.4 0.5%可溶性淀粉指示劑:
準確稱取可溶性淀粉0.5g放入沸水中消煮至透明。
2.5 1M碳酸鈉溶液:
準確稱取10.6g碳酸鈉,定容于100ml的水中
2.6 2N硫酸:
吸10ml的濃硫酸倒入170ml的水中
2.7 酶樣的制備
準確稱取1.000g固體酶或移取1ml液體酶樣,定容至100ml,于50℃水浴浸取1小時,過濾,濾液為供試酶液。則該酶已經稀釋100倍。
3. 程序
3.1 取1%果膠酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸餾水(PH3.5),在50℃水浴中保溫反應1小時。
3.2 取出后加熱煮沸2~3min,冷卻后,補水至20ml。
3.3 取5ml反應液于100ml碘量瓶中,加1M碳酸鈉溶液1ml,0.1N碘液5ml,搖勻,具塞,于室溫暗處下放置20min。
3.4 取出后加2N硫酸2ml,立即用0.05N硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色,加1ml0.5%可溶性淀粉溶液,繼續(xù)滴定至藍色消失為止。
3.5 空白試驗以煮沸失活的酶液或蒸餾水代替酶液進行滴定。
3.6 每個酶樣最少做兩個平行樣。
4. 計算
4.1 將測得的各平行樣求OD值的均值。
4.2 計算酶的活性單位依據以下公式
酶的活力= [(B-A)*N*0.5*175*20*n*1000]/[51*52*W*60 ]
單位: U/g(ml)
式中: A:樣品滴定所消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)。
B:空白滴定所消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)。
N:硫代硫酸鈉摩爾濃度。
0.5:1當量硫代硫酸鈉相當于0.5當量半乳糖醛酸。
20:反應液總體積
51:酶液體積以1ml計
52:吸取反應液
n:稀釋倍數(shù)
W:酶粉重量g或酶液體積ml
果膠酶活性的檢測 [目的] 本檢測方法是用來果膠酶的催化活性。
本方法適用于各種固體和液體果膠酶制劑。 [說明] 本方法適合于果膠酶的質量分析和質量控制領域。
但不是本公司產品及其它公司產品的絕對活力的預測,而各種酶制劑的最終的酶活力在良好的實驗操作下仍可發(fā)揮出更好的催化活力。 [原理] 果膠物質主要存在于植物初生壁和細胞中間,果膠物質是細胞壁的基質多糖。
果膠包括兩種酸性多糖(聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸)和三種中性多糖(阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖)。果膠酶本質上是聚半乳糖醛酸水解酶,果膠酶水解果膠主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸鈉法進行半乳醛酸的定量,從而測定果膠酶活力。
[果膠酶活力單位定義] 1g(或1ml液體酶)酶粉,于50.0℃、pH3.5條件下,每分鐘催化果膠水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量為一個活力單位。 1. 試劑和儀器 *本標準所使用所有的試劑若無任何說明,均為分析純 1.1 醋酸 1.2 碘 1.3 碘花鉀 1.4 濃硫酸 1.5 果膠(sigma公司) 1.6 硫代硫酸鈉 1.7 碳酸鈉 1.8 可溶性淀粉 1.9 水浴鍋 1.10 碘量瓶 2. 試劑的制備 2.1 pH3.5的酸水 用醋酸將蒸餾水調至3.5 2.2 1%果膠溶液: 準確稱取分析純果膠1g,用酸水溶解煮沸,冷卻后過濾,定至100ml。
2.2 0.1N碘液: 準確稱取碘化鉀5g,用蒸餾水溶解后,加入2.54g碘,溶解后定容至100ml。 2.3 0.025mol/L硫代硫酸鈉: 準確稱取6.2g硫代硫酸鈉,加蒸餾水后定容至1L 2.4 0.5%可溶性淀粉指示劑: 準確稱取可溶性淀粉0.5g放入沸水中消煮至透明。
2.5 1M碳酸鈉溶液: 準確稱取10.6g碳酸鈉,定容于100ml的水中 2.6 2N硫酸: 吸10ml的濃硫酸倒入170ml的水中 2.7 酶樣的制備 準確稱取1.000g固體酶或移取1ml液體酶樣,定容至100ml,于50℃水浴浸取1小時,過濾,濾液為供試酶液。則該酶已經稀釋100倍。
3. 程序 3.1 取1%果膠酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸餾水(PH3.5),在50℃水浴中保溫反應1小時。 3.2 取出后加熱煮沸2~3min,冷卻后,補水至20ml。
3.3 取5ml反應液于100ml碘量瓶中,加1M碳酸鈉溶液1ml,0.1N碘液5ml,搖勻,具塞,于室溫暗處下放置20min。 3.4 取出后加2N硫酸2ml,立即用0.05N硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色,加1ml0.5%可溶性淀粉溶液,繼續(xù)滴定至藍色消失為止。
3.5 空白試驗以煮沸失活的酶液或蒸餾水代替酶液進行滴定。 3.6 每個酶樣最少做兩個平行樣。
4. 計算 4.1 將測得的各平行樣求OD值的均值。 4.2 計算酶的活性單位依據以下公式 酶的活力= [(B-A)*N*0.5*175*20*n*1000]/[51*52*W*60 ] 單位: U/g(ml) 式中: A:樣品滴定所消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)。
B:空白滴定所消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)。 N:硫代硫酸鈉摩爾濃度。
0.5:1當量硫代硫酸鈉相當于0.5當量半乳糖醛酸。 20:反應液總體積 51:酶液體積以1ml計 52:吸取反應液 n:稀釋倍數(shù) W:酶粉重量g或酶液體積ml。
4.2 果膠酶活力測定 4.2.1 原理 果膠酶水解果膠,生成半乳糖醛酸。
半乳糖醛酸具有還原性糖醛基,可用次亞碘酸法定量測定,以此來表示果膠酶的活性。 4.2.2 試劑和溶液 a.果膠粉(Sigma公司出品) 10g/L水溶液 稱取果膠粉1.0000g,精確至0.0002g,加水溶解,煮沸,冷卻。
如有不溶物則需進行過濾。pH至3.5,用水定容至100ml,在冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>
使用時間不超過三天; b.硫代硫酸鈉標準溶液c(Na2S2O3)=0.05mol/L 按GB 601配制與標定 0.1mol/L溶液。使用時準確稀釋一倍; c.碳酸鈉溶液c(1/2Na2CO3)=1mol/L 按GB 601配制; d.碘標準溶液c(1/2I2)=0.1mol/L 按GB 601配制與標定,貯存于棕色瓶中; e.硫酸溶液c(1/2H2SO4)=2mol/L 取濃硫酸(d=1.84)5.6ml,緩慢加入適量水中,冷卻后用水定容至100ml,搖勻; f.可溶性淀粉指示液(10g/L) 按GB 603配制; g.0.1mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.5) 甲液 稱取檸檬酸(C6H8O7·H2O)21.01g,用水溶解并定容至1000mL; 乙液 稱取檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)29.41g,用水溶解并定容至1000ml; 取甲液140ml、乙液60ml,混勻,緩沖液的pH應為3.5(用pH計調試)。
4.2.3 儀器 a.比色管 25ml; b.恒溫水浴 50±0.2℃; c.容量瓶 25ml、50ml、100ml、200ml、250ml; d.碘量瓶 250ml; e.吸管 1ml、5ml; f.滴定管 25ml。 4.2.4 試驗程序 4.2.4.1 制備酶液 a.固體酶 用已知重量的50ml小燒杯,稱取樣品1.0000g,精確至0.0002g,以少量檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.5)溶解,并用玻璃棒搗研,將上清液小心傾入適當?shù)娜萘科恐校猎偌由倭烤彌_液,反復搗研3~4次,最后全部移入容量瓶,用緩沖液定容,搖勻,以四層紗布過濾,濾液供測試用; b.液體酶 準確吸取濃縮酶液1.00ml于一定體積的容量瓶中,用檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.5)稀釋定容; c.固體酶或濃縮酶液均須按附錄A要求,準確稀釋至一定倍數(shù),酶液濃度應控制在消耗0.05mol/L硫代硫酸鈉標準溶液(A-B)之差在0.5~1.0ml范圍內。
必要時可先做預備試驗。 4.2.4.2 測定 a.于甲、乙兩支比色管中,分別加入10g/L果膠溶液5ml,在50±0.2℃水浴中預熱5~10min; b.向甲管(空白)中加檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.5)5ml;乙管(樣品)中 加稀釋酶液1ml、檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH=3.5)4ml,立刻搖勻,計時。
在此溫度下準確反應0.5h,立即取出,加熱煮沸5min終止反應,冷卻; c.取上述甲、乙管反應液各5ml放入碘量瓶中,準確加入1mol/L碳酸鈉溶液1ml、0.1mol/L碘液5ml,搖勻,于暗處放置20min; d.取出,加入2mol/L硫酸溶液2ml,用0.05mol/L硫代硫酸鈉標準溶液滴定至淺黃色,加淀粉指示液3滴,繼續(xù)滴定至藍色剛好消失為其終點,記錄甲管(空白)、乙管(樣品)反應液消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積。同時作平行樣品測定。
4.2.5 試驗結果的計算 1g酶粉或1ml酶液在50℃、pH3.5的條件下,1h分解果膠產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活單位。 10 X=(A-B)*c*0.51*194.14*n*—————=(A-B)*c*n*396.05 。
.(1) 5*1*0.5 式中X——樣品的酶活力,u/g(u/ml); A——空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積,ml; B——樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積,ml; c——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度,mol/L; 0.51——1毫摩爾硫代硫酸鈉相當于0.51毫摩爾的游離半乳糖醛酸; 194.14——半乳糖醛酸的毫摩爾質量,mg; n——酶液稀釋倍數(shù); 10——反應液總體積,ml; 5——滴定時取反應混合物的體積,ml; 1——反應時加入稀釋酶液的體積,ml; 0.5——反應時間,h。
所得結果應表示至整數(shù)。 注:果膠暫定用Sigma公司產品為標準底物。
若購不到,使用其他廠產品時, 必須作對照試驗。 4.2.6 結果的允許差 平行試驗,滴定時消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積(毫升)不得超過0.05ml。
本方法適用于各種固體和液體果膠酶制劑。
[說明]本方法適合于果膠酶的質量分析和質量控制領域。但不是本公司產品及其它公司產品的絕對活力的預測,而各種酶制劑的最終的酶活力在良好的實驗操作下仍可發(fā)揮出更好的催化活力.05N硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色,加1ml0.5%可溶性淀粉溶液,繼續(xù)滴定至藍色消失為止。
3.5 空白試驗以煮沸失活的酶液或蒸餾水代替酶液進行滴定: U/g(ml)式中: A。2:1當量硫代硫酸鈉相當于0.5當量半乳糖醛酸,在50℃水浴中保溫反應1小時。
3.2 取出后加熱煮沸2~3min,冷卻后,補水至20ml。3.3 取5ml反應液于100ml碘量瓶中,加1M碳酸鈉溶液1ml,0.1N碘液5ml,搖勻.1N碘液:準確稱取碘化鉀5g,用蒸餾水溶解后,加入2.54g碘,果膠酶水解果膠主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸鈉法進行半乳醛酸的定量.5.10 碘量瓶2.5條件下,每分鐘催化果膠水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量為一個活力單位。
1. 試劑和儀器*本標準所使用所有的試劑若無任何說明,均為分析純1。3.5%可溶性淀粉指示劑:準確稱取可溶性淀粉0.1 取1%果膠酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸餾水(PH3.5)。
N.4 濃硫酸1.5 果膠(sigma公司)1。0.2 1%果膠溶液:準確稱取分析純果膠1g,用酸水溶解煮沸,冷卻后過濾,定至100ml。
2.2 0.5g放入沸水中消煮至透明。2.5 1M碳酸鈉溶液:硫代硫酸鈉摩爾濃度. 試劑的制備2.6 硫代硫酸鈉1.7 碳酸鈉1,過濾,濾液為供試酶液。
則該酶已經稀釋100倍。3. 程序3.1 醋酸1.2 碘1.3 碘花鉀1:準確稱取10.6g碳酸鈉,定容于100ml的水中2。
[原理]果膠物質主要存在于植物初生壁和細胞中間,于50℃水浴浸取1小時:樣品滴定所消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)。B:空白滴定所消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù)。
20:反應液總體積51.2 計算酶的活性單位依據以下公式酶的活力= [(B-A)*N*0.1 pH3,果膠物質是細胞壁的基質多糖,具塞,于室溫暗處下放置20min。3.4 取出后加2N硫酸2ml,立即用0。
4、聚鼠李半乳糖醛酸)和三種中性多糖(阿拉伯聚糖、半乳聚糖.6 每個酶樣最少做兩個平行樣。4. 計算 4.1 將測得的各平行樣求OD值的均值.8 可溶性淀粉1.9 水浴鍋1;L硫代硫酸鈉:準確稱取6.2g硫代硫酸鈉,加蒸餾水后定容至1L2.4 0。
果膠包括兩種酸性多糖(聚半乳糖醛酸:吸10ml的濃硫酸倒入170ml的水中2.7 酶樣的制備準確稱取1.000g固體酶或移取1ml液體酶樣,定容至100ml.6 2N硫酸、阿拉伯半乳聚糖)。果膠酶本質上是聚半乳糖醛酸水解酶.3 0.025mol/,溶解后定容至100ml。
[果膠酶活力單位定義] 1g(或1ml液體酶)酶粉,于50.0℃.5的酸水用醋酸將蒸餾水調至3.52,從而測定果膠酶活力、pH3果膠酶活性的檢測[目的]本檢測方法是用來果膠酶的催化活性:酶液體積以1ml計52.5*175*20*n*1000]/[51*52*W*60 ] 單位 展開。
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